酵母葡聚糖硫酸酯化修饰及其对小鼠脾淋巴细胞增殖的促进作用.doc

酵母葡聚糖硫酸酯化修饰及其对小鼠脾淋巴细胞增殖的促进作用摘 要 目的：研究免疫增强活性较好的酵母葡聚糖硫酸酯(SPS)的修饰条件。 方法：通过 L9(3)4正交设计对氯磺酸-吡啶法制备 SPS 的工艺进行优化， 并以 MTT 法测定其对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的促进作用。结果：最佳修饰条件为氯磺酸吡啶=16（V/V），反应温度 70，反应时间3h，硫酸基取代度可达 1.092。 在 50200 gmL-1内，最佳工艺所得 SPS 对小鼠脾淋巴细胞生长有显著促进作用，平均增殖率可达 89.85%。 结论：优化方法制备的 SPS 对小鼠脾淋巴细胞生长具有显著的促进作用。关键词 葡聚糖；酵母；氯磺酸-吡啶法；淋巴细胞我国的酵母资源十分丰富， 年产啤酒沉淀酵母泥35 万吨(干基)，目前该资源仅作为饲料廉价销售或直接作为废物排入下水道， 既造成环境污染又造成资源浪费1。酵母细胞壁是生物活性较强的-1,3 -D-葡聚糖的重要来源之一， 其中碱不溶性 -1,3-D-葡聚糖占 85%2。 由于其分子量大，在水中溶解性差，使其在应用上受到很大限制。 利用现代生物技术对酵母废泥进行充分开发利用，使其中 -1,3-葡聚糖得以综合利用， 将大力推动医药产业的发展。多糖硫酸酯化修饰后由于所带硫酸基团的空间位阻和静电排斥效应改变了原来的空间结构，增加了糖链的屈伸度，提高了水溶性，从而引起生物活性的改进与改变3。现今多用氯磺酸-吡啶（Wolfrom）法进行改良，借以达到不同的修饰目的4-6。 本研究通过控制酯化试剂比例、反应时间、反应温度，开展酯化工艺的研究， 以制备免疫活性较好的酵母葡聚糖硫酸酯（SPS）。1 仪器与药材冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；二氧化碳培养箱（Thermo）；酶标仪（Bio-Tek）；倒置显微镜（Olympus）；透析袋（南京都莱生物技术有限公司）；96孔培养板(Costar)。酵母葡聚糖（纯度 90%，本校微生物学教研室提供）；无水吡啶、无水二甲基亚砜（DMSO）、刀豆蛋白（ConA）为 Sigma 产品；RPMI 1640 培养基、新生小牛血清为Gibco 产品 ； 四甲基偶氮唑盐 （MTT）为Amresco 产品；其它试剂均为分析纯。清洁II 级雄性 ICR 小鼠，体重(202) g；中国药科大学实验动物中心提供，动物合格证号 SCXK(苏)2008-0010。2 方 法2.1 酵母葡聚糖的硫酸酯化将吡啶加入附有冷凝管和搅拌装置的三颈瓶中，置于冰盐浴， 逐滴加入氯磺酸，10 min 滴加完毕。 再加入酵母葡聚糖 20 mg，立即将其移入预热的油浴中于40100恒温反应。 反应完毕后，将反应液倾入冰水中， 以 10 molL-1NaOH 调至 pH 中性，以去离子水透析48 h， 透析液浓缩醇沉、 复溶、冻干，即得 SPS，得率 80.78%。2.2 SPS 对小鼠淋巴细胞生长的影响7将小鼠脱颈处死，取脾脏，去外周结缔组织，并用不含血清的RPMI 1640 培养液清洗脾脏，以匀浆器研磨脾脏成单个脾细胞，200目的尼龙筛网滤过，以红细胞裂解液1000 rmin-1离心洗涤细胞两次，以培养基洗涤一次，最后以含10%小牛血清的 RPMI 1640 培养液悬浮细胞，置37恒温、5% CO2孵箱中孵育46 h，除去贴壁的巨噬细胞，悬浮的即为小鼠脾淋巴细胞。以培养基调整小鼠脾淋巴细胞浓度至5106/L，于96 孔板每孔加 100 L 细胞悬液， 再加入含 SPS 培养液（终浓度分别为 50、100、200 gmL-1），每孔终体积为200 L，同时设定空白对照和阳性对照（ConA，终浓度7.5 gmL-1）。 每浓度设 4 个复孔，置 37、5% CO2培养44 h 后，每孔加入 MTT（5mgmL-1）20 L，继续培养4 h，3000 rmin-1离心20 min，弃上清液，每孔加入DMSO 100 L，混匀，酶标仪 570 nm 处检测吸光值。2.3 酵母葡聚糖硫酸酯化条件的优化8以免疫细胞的增殖率为响应值， 采用 3 因素 3 水平的正交实验L9(34)对试剂比例、反应温度和反应时间进行正交试验优化。 正交实验方案及结果列于表 1 中。2.4 硫酸根含量的测定及取代度的换算9采用氯化钡-明胶比浊法测定多糖样品中的硫酸根含量。分别吸取浓度为 1.0mgmL-1的硫酸钾标准品溶液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，各以 1 molL-1的盐酸溶液补至4 mL，摇匀，分别加入 3.5 mL 0.8%的三氯乙酸溶液，摇匀，再分别加入 2.5 mL 氯化钡-明胶溶液（1.0 g BaCl2溶解于200 mL 的 0.5%的明胶水溶液中），摇匀，室温下静置 1520 min，以第一管为空白对照，测定360 nm 处吸光度。 精密称定 SPS10.0 mg，置玻璃瓶中，加 1 molL-1盐酸溶液10mL，振摇至供试品全溶，于 100水解 6 h。 冷却后，过滤除去不溶物即得供试品溶液。 取供试品溶液 4 mL 两份，各加3.5 mL 0.8%的三氯乙酸溶液，摇匀，一份加 2.5 mL 的氯化钡-明胶溶液， 另一份加 2.5 mL 的明胶溶液，摇匀， 其余操作同标准曲线。 以取代度 （Degree ofsubstitution,Ds） 表示每个葡萄糖残基上硫元素的个数，取代度的计算公式为：Ds1.62(s)/32-1.02(s)，其中 (s)为样品中硫的百分含量。3 结 果3.1 SPS 对小鼠脾淋巴细胞的促增殖作用通过MTT 法考察梯度浓度 SPS（样品终浓度分别为50、100、200 gmL-1） 对小鼠脾淋巴细胞的体外促增殖作用，结果如图 1。图1 硫酸酯化酵母葡聚糖对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用(注：与空白组对照，细胞增殖的显著性差异，#P0.05,#P反应时间试剂比例，最佳组合为酯化试剂比例1： 6、反应温度 70及反应时间 3 h。对上述指标的结果进一步进行方差分析（见表2），结果表明 ，酯化反应各因素对小鼠脾淋巴细胞增殖率均有显著的影响(P0.05)。用优化工艺进行3 批验证实验，淋巴细胞增殖率分别为96.94%、85.16%、87.46%，平均值为 89.85%。 以最佳工艺制备得到的三批样品， 活性一致且稳定，达到了正交实验设计的最佳水平。3.3 SPS 硫酸根含量的测定及取代度的换算以360 nm 处吸光值对硫元素含量做标准曲线，为Y=0.0535X+0.0429（r2=0.9903）， 根据回归方程计算出硫元素百分含量为12.78%，换算为硫酸基取代度为1.09。表1 酵母葡聚糖硫酸酯化的正交试验序号氯磺酸： 吡啶（V/V）反应温度（）反应时间（h）误差淋巴细胞增殖率（%）1 1： 4 40 2 1 37.12 1： 4 70 3 2 68.233 1： 4 100 4 3 -10.64 1： 6 40 3 3 86.945 1： 6 70 4 1 85.1667891： 61： 81： 81： 81004070100142322313.2364.4446.0524.6K1K2K3R31.5758.4445.0326.8766.4866.835.7461.0928.7959.9246.3331.13表2 方差的分析因素偏差平方和自由度F 比F 临界值显著性试剂比例1373.6 2 36.13 19 P0.05反应温度7339.46 2 193.03 19 P0.05反应时间1781.67 2 46.86 19 P0.05误差38.02 2 1 19 P0.05药学与临床研究Pharmaceutical and Clinical Research药 学研 究225Sulfation for Modification of Glucan from Saccharomyces cervisiae and ItsEnhancement of Lymphocytes GrowthNIE Yu, WANG Wen-yi, ZHOU Fei, YIN Hong-ping*, WANG Min*School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, ChinaABSTRACT Objective: To optimize the modification conditions for the preparation of sulfated glucanfrom Saccharomyces cervisiae (SPS) with high immune enhancement activity. Methods: SPS was preparedusing chlorosulfonic acid -pyridine method by L9(3)4orthogonal design, immunomodulatory activity of SPSwas examined by the lymphocytes experiment. Results: The optimized conditions were volume ratio ofchlorosulfonic acid to pyridine at 1： 6, reaction temperature at 70 and reaction time for 3 h. The contentof sulfur in SPS and the degree of substitution (Ds) were achieved to be 12.78% and 1.09. In the range of50 200 gmL-1, the lymphocytes -activating activity was significantly enhanced by SPS compared withcontrol group (P0.01), with the mean proliferation rate at 89.85%. Conclusion: The SPS prepared by theproposed method has higher sulfur content and enhances the proliferation rate of lymphocytes from thespleen of ICR mice significantlyKEY WORDS Glucan; Saccharomyces cervisiae; Chlorosulfonic acid-pyridine; Lymphocytes4 讨 论本研究所要解决的技术问题是对酵母葡聚糖进行结构修饰， 将水不溶的葡聚糖转变为水溶性的、有显著生物活性的葡聚糖，提供一种毒性低、成本低的硫酸酯化酵母葡聚糖用于制备免疫增强剂。实验采用氯磺酸-吡啶法，该方法用酯化试剂，简单易得，反应条件温和，产物回收方便。 实验中应缓慢滴加氯磺酸，否则生成的酯化试剂颜色加深，影响反应效果。随氯磺酸比例增高，易出现板结，搅拌困难。 本实验过程中发现，并非较高的氯磺酸比例、反应温度及较长的反应时间得到的产物有较高的生物活性。 原因可能是过于剧烈的反应条件易造成糖链结构的破坏，引起多糖的降解等。 在最佳的工艺条件下， 即氯磺酸与吡啶的体积比 16， 反应温度70，反应时间 3 h，产物显著增强小鼠脾淋巴细胞增殖，平均增殖率可达 89.85%，产物中硫的质量分数和取代度分别达12.78%和 1.09。多糖的硫酸化反应是在路易斯碱溶液中由SO3H+取代多糖羟基中的H+， 经中和得到多糖硫酸盐10。 硫酸酯化的多糖结构发生了变化，而这种变化导致了理化性质及生物活性的改变。本实验以多糖的免疫活性为导向，探索酵母葡聚糖活性修饰产物的最佳制备工艺，为该多糖资源的利用和糖药物的研究提供了基础。 在以后的研究中可以进一步改良工艺，以克服硫酸化试剂稳定性差、较难提高氯磺酸比例等问题，并深入进行多糖分子构效关系及作用机制的研究。参考文献1 黄国宏，李科德，曾庆孝.酵母 -1,3-葡聚糖研究进展J.酿酒科技，2006， 150(12)： 100-3.2 刘红芝 ，王 强 ，周素梅 ，等.酵母 葡聚糖的功能活性及其分离提取研究进展J.食品科学，2006，27(11)：552-5.3 邱 琳，辛现良，耿美玉.多糖构效关系研究进展J.现代生物医学进展，2009，9(9)：1764-8.4 Wang YF, Peng YH, Wei XL, et al. Sulfation of teapolysaccharides: Synthesis, characterization and hypogly-cemic activityJ. Int J Bio Macromol, 2010, 46(2): 270-4.5 Chen D, Yao WJ, Zhang XL, et al. Effects of Gekkosulfated polysaccharide -protein complex on humanhepatoma SMMC -7721 cells: Inhibition of proliferationand migrationJ. J Ethnopharmacol, 2010, 127(3): 702