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第六章抗体工程制药 药学院药剂教研室高秀蓉 第一节概述 一 基本概念 1 抗体 antibody Ab 指机体的免疫细胞被抗原激活后 由B淋巴细胞增殖分化成的浆细胞所产生的 可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白 主要分布在血清中 也分布于组织液及外分泌液中 即能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白 2 免疫球蛋白 immunoglobulin Ig 具有抗体活性或化学结构上与抗体相似的球蛋白 因结构不同可分为IgG IgA IgM IgD和IgE5种 免疫球蛋白是结构及化学的概念 而抗体是生物学及功能的概念 3 抗原 antigen Ag 一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答 并能与相应免疫应答产物 抗体 在体内外发生特异性结合的物质 抗原的基本特性有两种 一是诱导免疫应答的能力 也就是免疫原性 二是与免疫应答的产物发生反应 也就是反应原性 抗原的分类 完全抗原 completeantigen 简称抗原 是一类既有免疫原性 又有反应性性的物质 如大多数蛋白质 细菌 病毒 细菌外毒素等都是完全抗原 不完全抗原即半抗原 是只具有免疫反应性 而无免疫原性的物质 如 多糖 青霉素 磺胺剂和花粉等 半抗原与蛋白质载体结合后 就获得了免疫原性 4 抗原表位 epitope 指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团 又称为抗原决定簇 抗体工程制药 antibodyengineeringpharmaceutics 是指利用基因工程 细胞工程和转基因动植物技术生产抗体药物的过程 抗体药物的应用 治疗肿瘤目前在临床中使用的肿瘤治疗药物多数存在 敌我不分 的问题 即在杀死肿瘤细胞的同时 也破坏了人体正常细胞 生物导弹 为解决这个难题提供了一个理想的思路 生物导弹 即将各种毒素 放射性同位素 化疗药物与识别肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原的抗体偶联后 能够特异杀伤肿瘤细胞的一类药物 这种药物经由静脉注入人体内 药效分子集中作用于肿瘤细胞 既增强疗效又减少对机体的毒副作用 放射性同位素与抗体的偶联物在体内能将前者运至药靶部位 并通过其放射性活性杀伤靶细胞 逆转器官移植排斥进行器官移植时 可以采用某些抗体类药物来逆转器官移植引起的排斥反应 如最早批准 1986年 进入美国市场的治疗性抗体类药物 抗CD3单抗即被用于肾 心脏 肝脏移植排斥的逆转 目前正在进行开发和已经投入市场的抗体药物主要有以下几种用途 1 器官移植排斥反应的逆转 2 肿瘤免疫诊断 3 肿瘤免疫显像 4 肿瘤导向治疗 5 哮喘 牛皮癣 类风湿性关节炎 红斑狼疮 急性心梗 脓毒症 多发性硬化症及其他自身免疫性疾病 6 抗独特型抗体作为分子瘤苗治疗肿瘤 抗体工程的发展 1937年用电泳法将血清分为白蛋白 甲种 乙种 丙种球蛋白 并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分 1975年 kohler和milstein首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体 得以规模化制备特异性 均质性抗体 通过基因工程技术制备人 鼠嵌合抗体 人源化抗体等 抗体技术发展经历的三个阶段 第一代 抗血清多克隆抗体第二代 70年代中期 利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备的杂交瘤单克隆抗体 McAb 第三代 基因工程抗体 多克隆抗体 polyclonalantibody pAb 天然抗原分子中常含有多种抗原决定簇 以该物质刺激机体 体内多个B淋巴细胞被激活 产生的抗体实际上含有针对多种不同抗原表位的抗体 是多克隆抗体 1 抗血清 动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系 不同的B淋巴细胞合成不同的抗体 多克隆抗体的产生过程 当机体受抗原刺激时 抗原分子上的许多决定簇分别激活各个B细胞 被激活的B细胞分裂增殖形成浆细胞 大量的浆细胞合成和分泌大量的抗体分子分布到血液 体液中 获得多抗的途径 动物免疫血清恢复期患者血清免疫接种人群血清 动物抗血清的优缺点 从动物血清提取抗体主要克服了人血浆来源有限造成的制约 然而 动物来源产品均存在潜在的危险 如过敏和传播感染性病原体等 多抗体异性不高 易发生交叉反应 解决单抗特异性不高的理想方法是针对单一表位的特异性抗体 单克隆抗体 2 单克隆抗体 monoclonalantibody mAb 如果能选出一个浆细胞进行培养 就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群 即单克隆 单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体 称为单克隆抗体 mAb 单克隆抗体的概念 问题 浆细胞在体外寿命短 难以培养和扩增 怎么办 解决办法 1975年 kohler和milstein将以下两种细胞融合 B细胞 能产生抗体 但寿命短 骨髓瘤细胞 寿命长 杂交瘤细胞 mAb制备过程 每个杂交瘤细胞由一个B细胞与一个骨髓瘤细胞融合 仅合成和分泌抗单一抗原表位的特异性抗体 即单克隆抗体 优点 结构单一 特异性强 交叉反应少 问题 从动物脾脏B细胞获得的单克隆抗体 即鼠源性抗体 对人具有较强的免疫原性 会产生人抗鼠抗体 HAMA 对单克隆抗体进行改造 产生了基因工程抗体 3 基因工程抗体 geneticallyengineeredantibodies gAb 是通过基因工程技术获得抗体 即通过PCR技术获得抗体基因 与载体重组后 引入表达系统后 表达产生的抗体 优点 即保持了单抗的均一性 特异性强的优点 又能克服其作为鼠源性抗体的不足 简言之 基因工程抗体就是将人源抗体的编码基因克隆到真核或原核表达系统中 体外表达人源化抗体其根本出发点是解决抗体的鼠源性问题 第二节抗体分子的结构和功能 二 抗体的结构 一 基本结构 1 轻链 lightchain L链 由214个氨基酸残基组成 相对分子量25kD 同一抗体分子上2条L链总是相同 2 重链 heavychain H链 由450 570个氨基酸组成 相对分子量约50 70kD 每条H链含有4 5个链内二硫键所组成的环肽 为球形 3 可变区 V区 和恒定区 C区 V区 近N 端轻链的1 2区段 重链的1 4或1 5区段的氨基酸组成及排列顺序多变 分为VL和VH C区 近C 端轻链的1 2区段 重链的3 4或4 5区段的氨基酸组成较恒定 分为CH1 CH2 CH3 可变区是指此区域内的氨基酸序列在不同的抗体中不同 恒定区是指此区域内的氨基酸序列在不同的抗体中相同 4 超变区 HVR区 和骨架区 FR HVR 可变区中 某些特定位置的氨基酸残基显示更大的变异性 它们共同组成抗原结合部位 该部位在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补 也称为互补决定区 complementary determiningregion CDR 分别称为CDR1 CDR2 CDR3 FR 可变区中氨基酸残基变化小的部分 维持空间结构 5 铰链区 hingeregion CH1和CH2之间的区域 含大量脯氨酸 具有弹性 易发生伸展及一定程度扭曲 有利于与抗原表位间的互补性结合 二 功能区 1 抗体的功能区由一条多肽链折叠而成的球形结构域称为功能区 每个功能区约由110个氨基酸组成 具有不同生物学功能 2 各功能区的功能VH和VL共同构成抗原特异性结合部位 补体结合位点 借助CH2通过胎盘屏障 三 水解片段 Ig分子中有些部位在一定条件下 容易被蛋白酶水解为各种片段 常用的蛋白酶有木瓜蛋白酶和胃蛋白酶 Ig酶解的片段获得 大大促进了Ig分子结构和功能的研究 同时也为各种基因工程抗体的构建打下了基础 如DNA操作和抗体改型技术的发展 使得人们可根据抗体水解片段的结构和功能关系 产生更多有功能的Ig改型分子片段 1 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶水解Ig分子可产生2个抗原结合片段 fragmentofantigen binding Fab 一个可结晶片段 fragmentcrystalizable Fc Fc片段相当于两条重链的CH2和CH3功能区 由二硫键连接 可形成结晶 其无抗原结合活性 但具有固定补体 结合Fc受体等功能 Fab片段包括完整的轻链和部分重链 VH和CH1 能与一个抗原特异性结合 具有单价抗体活性 可通过基因工程获得Fab片段 2 胃蛋白酶水解Ig分子可产生1个F ab 2 若干个裂解的小分子片段 pFc F ab 2含有两条L链和略大于Fab段的H链 由二硫键连接 具有双价抗体活性 四 抗体的功能 一 V区的功能 识别并结合抗原 二 C区的功能 激活补体系统介导免疫细胞活性穿过胎盘和粘膜 第三节单克隆抗体的制备 主要分为以下几个步骤 抗原的制备动物的免疫抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合 形成杂交瘤细胞杂交瘤细胞的选择性培养与筛选大量制备单克隆抗体 一 单克隆抗体技术的基本原理 B淋巴细胞能够产生抗体 但在体外不能进行无限分裂 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代 但不能产生抗体 将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性 两类细胞融合物中存在以下细胞 未融合的单核亲本细胞 脾 瘤细胞 同型融合多核细胞 脾 脾 瘤 瘤融合细胞 异型融合双核细胞 脾 瘤融合细胞 杂交瘤细胞的筛选 使用HAT H为次黄嘌呤 A为氨基蝶呤 T为胸腺嘧啶核苷 培养基 HAT筛选杂交瘤细胞的原理 哺乳动物细胞中 DNA前体物的合成有两种不同的途径 从头合成途径 可被氨基蝶呤阻断补救合成途径 需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 HGPRT 或胸腺嘧啶核苷激酶 TK 存在 骨髓瘤细胞株 从头合成途径被A阻断 是HGPRT缺陷 HGPRT 和TK缺陷 TK 不能利用培养基中的H和T完成DNA的合成而死亡 二 抗原和免疫 一 抗原的制备 1 提取纯化天然抗原 运用蛋白质等分离纯化技术分离蛋白质分子作为抗原 对于含量低的蛋白分离纯化成本高 目前已少用 2 用基因工程技术制备重组蛋白抗原 可获得足够数量蛋白抗原 原核系统只能提供连续氨基酸表位的抗原 真核及哺乳动物细胞系统可解决抗原构象表位 但产量低 成本过高 3 合成多肽半抗原 根据抗原蛋白的氨基酸序列 经人工合成抗原表位的多肽片段 即多肽半抗原 该方法效率高 成本低 已成为抗原制备的主要来源 半抗原 只有反应原性而无免疫原性的物质 其可与抗体或致敏淋巴细胞特异性结合 但不能单独诱发免疫应答 小分子半抗原抗生素 青霉素等 农药 重金属等属于小分子半抗原 多肽半抗原及小分子半抗原与载体偶联载体如牛血清清蛋白 BSA 等 二 动物及免疫 免疫接种的目的是使B细胞在特异性抗原刺激下分化 增殖 分泌特异性抗体 1 动物的选择 一般采用与骨髓瘤供体同一品系的动物进行免疫 常用的骨髓瘤品系来自Balb c小鼠和Lou大鼠 免疫动物也采用相应品系 Balb c小鼠 2 免疫方法 有体内 体外和脾内免疫法 体内免疫法适用于免疫原性强 抗原量较多 体外免疫体外免疫是指在一定条件下 在体外将正常脾细胞与抗原共同培养 然后再与骨髓瘤细胞进行融合 体外免疫方法 分离小鼠脾细胞或淋巴细胞 RPMI1640培养液中 加适量滋养细胞与抗原 37度5 CO2培养3天 体外免疫方案免疫效果不如其它方案 仅用于抗原量极少 抗原免疫原性弱的抗原 用于不能采用体内免疫法的情况 脾内免疫小鼠麻醉后 打开腹腔 沿脾脏长轴方向缓慢注入0 1 0 2ml可溶性抗原 免疫后3 4d即可取脾细胞进行融合 目前最常用的是体内免疫法 3 乳化 为增强免疫原性 常加入佐剂 弗氏佐剂 初次免疫时 抗原需要与一定量弗氏完全佐剂混合 经乳化后应用 加强免疫时 可以用不完全佐剂 或不用佐剂 弗氏完全佐剂 由油剂 石蜡油或植物油 乳化剂 羊毛脂或吐温 Tween 80 灭活的分枝杆菌 卡介苗 组成 有比较强烈的刺激免疫系统 被免疫系统认为是外界物质的作用 能刺激免疫系统产生应答 弗氏不完全佐剂 只有石蜡油和羊毛脂 缺少灭活的结核菌的弗氏佐剂 弗氏完全佐剂用于初次免疫刺激 弗氏不完全佐剂用于加强免疫 乳化 用佐剂将抗原包裹使之形成油包水乳剂 乳化方法有 乳钵研磨 机械搅拌等 4 体内免疫途径 皮下 腹腔和静脉注射等 抗原量多 皮下 皮内和足掌等多点注射 抗原量少 体内免疫后药物吸收进入血液 5 免疫程序 初次免疫 Ag100 500ug加弗氏完全佐剂注射 第二次免疫 剂量同上 加弗氏不完全佐剂注射 加强免疫 融合前免疫 无菌取脾 制备脾细胞 第三次免疫 剂量同上 加弗氏不完全佐剂注射 4周后 4周后 5 7天采血 检测抗体效价 2周后 3天后 三 细胞融合和杂交瘤细胞的选择 细胞融合 cellfusion 是2个或2个以上的细胞合并成一个细胞的过程 免疫动物的脾细胞 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 所需要的细胞 免疫动物的脾细胞 骨髓瘤细胞 饲养细胞 一 细胞的准备 1 免疫脾细胞 指处于免疫状态脾脏中的B淋巴母细胞 取加强免疫以后3天的脾脏制备B淋巴母细胞 此时 脾脏体积是正常鼠脾脏体积的2倍 B淋巴母细胞比例较大 融合成功率较高 免疫脾细胞制备操作步骤 小鼠最后一次加强免疫3天后 摘除眼球取血 断颈处死 浸泡于75 酒精消毒 无菌剪刀分离脾脏 脾脏用RPMI培养液洗涤一次 制成细胞悬液 晒网过滤 细胞计数 离心 弃上清 培养液重悬 冰水浴中备用 2 骨髓瘤细胞 融合前两周开始复苏 培养基RPMI1640 DMEM均可作为其培养基 小牛血清的浓度一般在10 20 1 10传代稀释 活细胞计数高于95 以保证骨髓瘤细胞处于对数生长期 3 饲养细胞 feedercell 加入的目的在于促进细胞生长繁殖 能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性 能释放某些生长刺激因子 常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞 脾细胞和胸腺细胞等 小鼠腹腔巨噬细胞制备操作步骤 融合前2 3天制备 Balb c小鼠 断颈处死 浸泡于75 酒精消毒 无菌剪刀剪开腹腔 暴露腹膜 无菌注射器注入腹腔培养液8 12ml 反复冲洗 吸出冲洗液 离心 弃上清 培养液重悬 加入96孔板 37度 CO2孵箱培养备用 二 脾细胞和骨髓瘤细胞的融合 取适量脾细胞和骨髓瘤细胞 3 1 5 1 进行混合 在聚乙二醇作用下诱导融合 2min左右 PEG浓度越高 促融率越大 但毒性也越大 常用浓度40 50 分子量4kD 常用方法有转动法和离心法 细胞融合流程图 将脾细胞和骨髓瘤细胞在离心管中混合 培养液洗1次 离心 弃上清 吸尽残留液体 37 水浴 加入细胞融合剂 加入不完全培养液 终止融合剂的作用 离心 弃上清 用含20 小牛血清RPMI1640 含HAT 融合后细胞悬液加入96孔板 孵箱培养 三 HAT选择杂交瘤细胞 在HAT培养基中 次日即可观察到骨髓瘤细胞相继死亡 融合后3 4天可在镜下观察到细胞克隆的形成 四 筛选阳性克隆及克隆化 筛选阳性克隆 screening 即筛选能分泌特异性单抗的杂交瘤细胞 方法 是用抗原分别检测杂交瘤细胞中分泌的抗体 常用的方法有酶联免疫吸附试验 ELISA 放射免疫测定 radioimmunoassay RIA 等 ELISA法的原理 其基本方法是将已知的抗体或抗原吸附在固相载体表面 加入酶标记的抗原或抗体 通过反应也结合在固相载体上 加入酶反应的底物后 底物被酶催化成为有色产物 产物的量与标本中受检物质的量直接相关 根据呈色的深浅进行定性或定量分析 ELISA实验流程示图 酶的催化效率很高 间接地放大了免疫反应的结果 使测定方法达到很高的敏感度 免疫敏感度可提高数千倍 达ng ml水平 例如 用酶免疫测定法测定口蹄疫抗体 其敏感度可达0 1ng ml 操作程序 加抗体包被 4 过夜 洗涤三次 抛干 加待检抗原 37 30分钟 洗涤三次 抛干 加酶标抗体 37 30分钟 洗涤三次 抛干 加底物液 37 15分钟 加终止液 用ELISA检测仪测定OD值 酶标板 酶标板 ELISAPLATE 在酶联免疫吸附试验 EnzymeLinkedImmunosorbentAssay ELISA 中 作为载体的固相聚苯乙烯 Polystyrene 表面对抗原 抗体或抗原抗体复合物的吸附也起着重要作用 酶标板根据其孔数可以分为48孔 96孔 一般常用的为96孔 酶标仪 即酶联免疫检测仪 是酶联免疫吸附试验的专用仪器 其工作原理基本上都是一致的 其核心都是一个比色计 即用比色法来分析抗原或抗体的含量 酶标仪 二 杂交瘤细胞的克隆 cloning 是指将阳性孔中分泌抗体的单个细胞分离出来 方法 克隆化的原则 对于检测阳性的杂交瘤细胞应尽早克隆化 有限稀释法 把杂交瘤细胞悬液稀释后 加入到96孔板 每孔一个细胞 三 杂交瘤细胞的冻存 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞是很有必要的 细胞冻存液 50 小牛血清 40 不完全培养液和10 DMSO 方法 室温降到0 再降到 70 转入液氮中 六 单克隆抗体的大量制备 体内培养法 利用活体动物作为生物反应器 将杂交瘤细胞注射到小鼠或大鼠的腹腔内生长并分泌单抗 方法是 腹腔注射杂交瘤细胞 7 10天后抽取腹水 离心 得上清液 降植烷 降植烷是一种免疫抑制剂 所以 提前一周注射降植烷 液体石蜡等免疫抑制剂 总的来说是为了提高单克隆抗体产生的效率 体外培养法 体外使用旋转培养容器培养杂交瘤细胞 从细胞培养上清液中获得抗体 该方法获得的抗体产量较体内培养法低 七 单克隆抗体的纯化 澄清和沉淀处理 离心沉淀 过滤 蛋白沉淀 分离纯化 层析技术 第四节基因工程抗体 单克隆抗体的缺点 绝大多数来源于小鼠或大鼠 人体使用鼠抗体会产生人抗鼠抗体 产生超敏反应 解决办法 制备人源性抗体 但人 人杂交瘤技术未实现突破 基因工程抗体 制备抗体基因 与载体连接后导入受体细胞 表达抗体 基因工程抗体包括 抗体抗体片段抗体偶联物抗体融合蛋白等 一 Fab与Fv Fab抗体片段 由重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成 Fv抗体片段 由一个VH和一个VL组成 通过非共价键结合组成 是抗体中具有完整抗原结合活性的最小功能片段 分子片段小 免疫原性弱 对实体瘤的穿透性强 Fv 可作为靶向载体药物 毒素等结合 用于肿瘤的治疗 二硫键稳定的Fv disulfide stablized dsFv 由一个VH和一个VL组成 是在VH和一个VL的适当位置各引入一个半胱氨酸 形成dsFv 二硫键远离CDRs互补决定区 不会影响与抗原的结合 二 单链抗体 SinglechainFv ScFv 是利用DNA重组技术将抗体的一条VH和VL基因 通过一条短肽链 一般为15个氨基酸 连接后表达出来的抗体片段 单链抗体的优点是 只含有V区 不含Fc段 不与非靶细胞结合 可作为药物的导向载体 分子小 容易进入组织 包括肿瘤 因而可用于肿瘤的诊断和治疗 因其为单链 易于进行分子改造 如与毒素等拼接成为免疫毒素 可以直接杀伤靶细胞 可由大肠杆菌等发酵 进行大批量生产 优于完整抗体 3 单链抗体在肿瘤治疗中的应用 构建和生产免疫毒素 immunotoxin 免疫毒素 抗体与毒素的偶联物可将毒素定位于靶细胞 对靶细胞进行特异性杀伤 是将单链抗体基因C末端与毒素基因相连 经表达后获得scFv与毒素的融