流式细胞术原理及应用.ppt

流式细胞术原理及应用 一 什么是流式细胞术 流式细胞仪的构造二 怎样设计流式实验 三 流式实验中涉及到的关键步骤四 常见流式细胞术应用 一 流式细胞术基本概念 流式细胞术 FlowCytometry 是对于处在快速直线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数 快速的定量分析和分选技术 研究对象为生物颗粒 如各种细胞 微生物及人工合成微球等 对生物颗粒的物理参数及生物学特性进行定性和定量分析 流式细胞仪构造图 流式细胞仪五大系统 流动室与液流驱动系统激光光源及光束成形系统光学系统信号检测与分析系统细胞分选系统 流动室与液流驱动系统 流动室 430 180um 鞘液 1 空气加压进样2 蠕动泵精确定量进样 激光光源与光束成形系统 1 氩离子气体激光器 22 66um2 固体激光器 405nm 488nm 561nm 635nm 光学系统 透镜 滤光片 小孔 LP long passfilterSP short passfilterBP band passfilter 信号检测与分析系统 物理参数FSC 前向角散色光 代表细胞大小SSC 侧向角散色光 代表细胞颗粒度 粒细胞 单核细胞 淋巴细胞 红细胞 死细胞和碎片 实验中 常利用FSC和SSC这两种参数的组合 区分不同的细胞群体 去除碎片 死细胞和粘连细胞的干扰 阈值 溶液中的杂质或者死细胞 很容易产生微小的干扰信号 所以必须设置阈值 排除杂质 细胞碎片或体积较小的死细胞 FSC反映细胞体积的大小 FCM应用时常选取FSC设定阈值 5 32 默认阈值 升高阈值后 荧光信号细胞自发荧光特异荧光素标记激发的荧光信号荧光信号的线性测量和对数测量 光电倍增管1 检测光子 转换成电信号2 将电信号等比例的放大荧光信号的面积 宽度和高度 由于光信号比较弱 需将其等比例放大 方便计算机分析处理 一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式 一般FSC和SSC变异范围较小 故使用线性放大 荧光信号变异范围较大 多使用对数放大 线性测量 DNA含量 RNA含量 总蛋白含量对数测量 细胞膜表面抗原检测 直方图 DistributionHistogram 横坐标 道数纵坐标 细胞数 散点图 DotPlot 横坐标 某细胞参数相对含量纵坐标 该细胞另一参数含量 等高线图 ContourPlot 细胞分选系统 MACS 技术 MageticActivatedCellSorting免疫学 细胞生物学 磁力学 电荷式分选超声振动器 15 100kHz 液流充电系统高压偏转板收集装置 流式管 离心管 培养板 载波片等 二 荧光素 荧光的概念 激发波长Excitationwavelength 发射波长 荧光波长 Emissionwavelength 激发光谱 特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光发射光谱 某一波长激发光引起荧光素发射的荧光 荧光素 FITC PE PerCP APC等 抗体偶联荧光素 分子探针结合荧光素AnnexinV FITC 荧光染料 荧光化合物PI 7 AAD等插入核酸链中 CFSE和蛋白质共价结合 荧光蛋白 如GFP RFP YFP CFP mCherry DsRed等 自身发荧光 常用荧光素 常用荧光染料 PI 碘化丙啶535 623 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中 常用于DNA分析 需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响 PI不能透过活细胞膜 常用于鉴定死细胞 7 AAD 7 氨基放线菌素D545 647 以插入的方式与DNA链的G C碱基对结合 不能透过活细胞膜 常用于鉴定死细胞 DAPI 4 4 6 二脒基二苯基吲哚358 456 可以非嵌入方式与DNA链上的A T碱基对特异性结合 变异系数明显小于其他染料 一种理想的DNA定量染料 Hoechst 343 450 常见为Hoechst33342和Hoechst33258 非嵌入的方式与DNA链上的A T碱基对结合 能对活细胞染色 用于活细胞DNA定量分析 如精子分选 还用于侧群细胞的分选 PY 派若宁560 573 RNA染料 能进入活细胞 AO 吖啶橙509 525 DNA RNA染料 染色后DNA呈黄绿色荧光 RNA呈橙黄色荧光 可进行DNA RNA双参数分析 三 如何设计流式实验 确定实验要检测的marker选择合适的荧光素标记的抗体选择合适的同型对照抗体 细胞处理 全血 培养的细胞 染色 室温 20min 离心洗涤 全血裂红 上机检测 准备工作 实验步骤 A 根据机器配置选择荧光素多色标记荧光素搭配原则 每个通道只能选择一种荧光素 各个通道之间的荧光素可以随意搭配 FACSCalibur常用四色搭配 FITC PE PerCP APC 1 荧光素的选择 B 根据抗原表达强弱合理分配荧光素 荧光素的强度 染色指数StainIndex StainIndex D W CD4 高表达的抗原可用不太 亮 的染料 更 亮 的荧光素分配给表达低的抗原 CD4 FITC CD25 APC FoxP3 PE FSC SSC CD4FITC SSC CD25APC Foxp3PE 尽量选择光谱重叠小的荧光素 如FITC PE Cy7 选择不同激光激发的荧光素 如FITC APC PE APC C 选择光谱重叠小的染料 D 尽量避免偶联染料使用带来的假阳性 0hour 2hours 22 5hours PE CD3PE Cy5 CD8PE Cy7 样本曝光时间 3 流式试验对照设置 A 空白对照NegativeControl细胞内物质自身也发出荧光 能被FCM灵敏的检测到 这种未染色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光 设置空白对照 未染色的细胞 用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光 避免假阳性的结果 流式结果中荧光强弱是一个相对值 光电倍增管电压越大 电子信号越强 电压越小 信号越弱 通过调节电压 使阴性对照管的荧光强度处于阴性的位置 实验组的荧光值都是相对对照组 001 001 002 同型对照抗体 与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型 Fc段相同 F ab 2段不同 与染色的单克隆抗体 相同种属来源 相同免疫球蛋白及亚型 相同荧光素标记 相同剂量和浓度 但由未免疫动物血清纯化而来用此消除由于抗体非特异性结合到细胞表面Fc受体而产生的背景染色 B 同型对照IsotypeControl C 阳性对照PositiveControl 设置阳性对照是为了检测荧光抗体是否有效 并不是每次分析时都必须设置 使用新的荧光素抗体时 使用存储时间较长的荧光素抗体时 设置阳性对照的方法 用肯定表达有该抗原的细胞来检测 已经证明有效的 偶联其他荧光素的该抗原的抗体 什么是荧光补偿 纠正荧光素发射光谱重叠为什么要进行补偿调节 520 400 500 600 700 575 665 FITC PE PC5 laser D 单标对照SingleStainingControl 补偿调节方法 FL2 FL1 FL 1 FITC FL 2 FL 1 FL 2 PE FL1 FL2 BeforeCompensation AfterCompensation FITC单标 PE单标 什么样的补偿最合适 单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median值相等时为最合适的补偿 Uncompensated Compensated FL1 FITCstain FL2 nostain FL1 FITCstain PE Medianneg PE Medianpos PE Medianneg PE Medianpos PE Medianneg PE Medianpos FL1 FITCstain Overcompensated 准确补偿的重要性 补偿调节要合适 未补偿 正确补偿 FITC PE补偿太大 PE FITC补偿太大 使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别染色n色分析就要制备n个补偿对照管 举例 双染实验 设门与数据分析 门 Gate 简写G 是流式细胞术中的一个重要术语 FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程 流式结果 十字门 线性门 细胞功能细胞表面 胞浆 核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性细胞受体细胞内钙离子 流式细胞仪检测范围 HIV免疫分型 CD4绝对计数白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检查HLA B27检查血小板功能及相关疾病 医学应用 科研应用 在免疫学研究中的应用 鉴定免疫细胞类型抗原特异性T细胞研究细胞因子分泌细胞研究全血细胞研究凋亡检测细胞增殖检测干细胞向免疫细胞分化的研究转染荧光蛋白细胞系研究稀有细胞检测 在神经生物学研究中的应用 神经干细胞和神经祖细胞的特性研究 不同类型的神经细胞的鉴定和功能研究 星形胶质细胞和胶质细胞的鉴定和功能研究 检测细胞活性 细胞凋亡和细胞周期 神经细胞发育过程研究干细胞向神经细胞分化研究 在肿瘤研究中的应用 细胞凋亡的检测 细胞周期分析 细胞增殖研究 荧光蛋白分析 肿瘤干细胞的鉴定和功能分析 循环肿瘤细胞的鉴定和功能分析 实体瘤细胞的检测分析 肿瘤组织解离成单细胞后 肿瘤细胞系表型分析 细胞活性的检测 在细胞生物学和分子生物学研究中的应用 检测细胞转染效率 检测转导效率 分析细胞中荧光蛋白的表达 分析蛋白 蛋白之间的相互作用 FRET 分析细胞活性 细胞凋亡 和细胞周期 研究细胞的分化过程 研究细胞增殖 在高通量检测和新药研发中的应用 细胞功能变化的研究 细胞周期和活性 细胞凋亡 细胞增殖 新药研发 培养基研发 海洋生物学富集和分析细菌 藻类 浮游植物等微生物学细菌和酵母检测 荧光蛋白检测 生物燃料Bodipy 和 或NileRed中脂类的定量藻类 蓝藻细菌 酵母和细菌等生物的富集 4 1细胞周期检测 处于不同细胞周期的细胞DNA含量不同 G0 G1期细胞含有二倍体量的DNA G2 M期细胞含有四倍体量的DNA 而S期细胞DNA含量处于二倍体和四倍体量之间 DNA荧光染料能与DNA结合 DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比 荧光强度反应了DNA吸收荧光分子的多少 通过流式检测就能反映细胞内DNA的含量 区分细胞周期的G0 G1期 S期和G2 M期细胞比例 四 常见流式细胞术应用 细胞周期分析核酸染料细胞膜非通透性染料 PI 碘化丙啶 EB 溴化乙啶 不能进入完整细胞膜 标记时需要通过固定等方法增加细胞膜的通透性 细胞膜通透性染料 Hoechst DPAI等能染活细胞的DNA 但需紫外激光激发 PI标记法检测细胞周期需要乙醇固定增加细胞膜的通透性 需要加RNase 去除RNA对DNA的干扰 PI法检测细胞周期一般步骤 收集单细胞悬液 1 106个 缓慢加入1ml预冷的70 乙醇 于4 固定过夜 或 20 长期固定 离心收集细胞 再以1mlPBS彻底洗去乙醇 去上清后加入染色液 包含50ug mlPI 100ug mlRNaseA 0 2 TritonX 100 37 染色30min后上机检测 细胞周期检测结果 通过流式检测 能得出G0 G1期 S期和G2 M期细胞比例 增殖指数 proliferousindex PI 指处于S期和G2 M期细胞之和占总细胞的比例 反映了细胞的增殖能力 CV值 变异系数 衡量仪器测量分辨率和精度的指标 脾脏细胞 培养肿瘤细胞 DNA倍体检测 病变肿瘤细胞常出现结构和染色体异常 流式检测DNA含量能反映异倍体情况 DNA指数 DNAindex DI 样本的G0 G1期峰平均荧光道数 正常二倍体细胞G0 G1期峰平均荧光道数 倍体 ploidy 染色体数目 二倍体DI 1 四倍体DI 2 二倍体四倍体之外统称异倍体 二倍体 四倍体 异倍体 小鼠精子单倍体细胞 亚二倍体 Sub G1 峰的检测 凋亡细胞核小体崩解 DNA含量减少 加之由于DNA的降解 与荧光染料的结合减少 因此DNA染料的着色能力下降 荧光强度降低 表现在G1峰前出现亚二倍体峰 即亚G1峰 凋亡峰 细胞凋亡峰Sub G1 四倍体峰 二倍体峰 PI Number 4 2AnnexinV PI双染法检测细胞凋亡 正常细胞膜是不对称性的 胞浆面含有带负电的磷脂 如磷脂酰丝氨酸 PS 早期凋亡时 细胞表面不对称性发生改变 PS外翻到胞外侧AnnexinV是一种Ca2 依赖性的对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白 可作为探针识别膜表面是否有PS 从而识别凋亡细胞 PI常用于鉴别死细胞 凋亡细胞的细胞膜仍然是完整的 所以PI不能进入早期凋亡细胞核内 AnnexinV FITC PI 活细胞 早期凋亡 晚期凋亡坏死细胞 裸核 免疫荧光图 ALA光敏剂 1mM M HL60氦氖激光 18mj cm2 4 3淋巴细胞亚群分析 Granulocytes Monocytes Basophils Lymphocytes PeripheralWhiteBloodCellsCD45 CD3 CD3 CD19 CD3 CD16 CD56 Monocytes CD14 淋巴细胞亚群分析 根据功能 淋巴细胞主要分为 T淋巴细胞 CD3 与细胞免疫有关 辅助性T细胞 CD3 CD4 helperTcells Th细胞 细胞毒性T细胞 CD3 C