细胞冷冻保存技术.ppt

动物细胞培养的方法之细胞冷冻保存技术 细胞的低温保存 细胞低温冷冻贮存是细胞培养的常规工作 细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力 经费 减少污染 减少细胞遗传性状的改变和延缓衰老 目前 动物细胞一般保存于液氮中 196 一般在原代或传代2 10次内即大量冻存 作为原种 stockcells 取一支细胞进行传代繁殖 用毕再冻存 这样可保证长期使用和延缓衰老 根据细胞冷冻液在在冻结后是否形成冰晶 低温冷冻保存细胞可分为 1 非玻璃化冷冻细胞在冷冻过程中 细胞内和细胞外的水形成冰晶 2 玻璃化冷冻细胞在冷冻过程中 细胞内和细胞外的水不形成冰晶 而是形成玻璃态 非玻璃化冷冻 原则 缓慢冷冻原因 当温度降低到冰点以下时 细胞内外的水分就会形成冰晶 细胞内形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的损伤 这种损伤称为细胞内冰晶损伤 细胞外的水形成冰晶后 使得未结冰的溶液中的电解质的浓度升高 细胞在这种高浓度的溶质中时间过长 会使细胞膜上的脂质受到损害 细胞膜破裂 这种损害称之为溶质损伤 如果缓慢冷冻 可使细胞逐步脱水 细胞内不致产生大的冰晶 从而减少细胞内冰晶对细胞的损伤 相反 结晶很大 大结晶会造成细胞膜 细胞器的损伤和破裂 在细胞冻存时加入冷冻保护剂 可以保护细胞免受冷冻损伤 原理 1 常用的低温保护剂是DMSO 它是一种渗透性保护剂 可迅速透入细胞 降低细胞的冰点2 提高胞膜对水的通透性 促进细胞内水渗出细胞外 减少细胞内冰晶的形成 从而减少冰晶对细胞的损伤 解冻时 促进细胞外水进入细胞内 缓解渗透性肿胀 3 稀释细胞内外未结冰溶液中的电解质 减少溶质损伤 解决办法 冷冻保护剂的应用 在培养液中添加的保护剂 二甲亚砜 Dimeethylsulfoide DMSO 甘油 可使细胞免受低温冰晶形成 及渗透压改变而导致的物理损伤 预先配制冻存保护液 含20 血清培养基 10 DMSO DMSO液用培养液配好 避免因临时配制产热而伤害细胞 冻存和复苏的原则 慢冻快融 当细胞冷到零度以下 可以产生以下变化 细胞器脱水 细胞中可溶性物质浓度升高 并在细胞内形成冰晶 如果缓慢冷冻 可使细胞逐步脱水 细胞内不致产生大的冰晶 相反 结晶很大 大结晶会造成细胞膜 细胞器的损伤和破裂 复苏过程应快融 目的是防止小冰晶形成大冰晶 即冰晶的重结晶 冻存培养细胞 1 预保留细胞经消化分散后 用将其预冷却 4度取对数生长期细胞 经胰酶消化后 加入适量冻存液 用吸管吹打制成细胞悬液 1 5 106细胞 ml 冷冻保护剂降温时减少细胞内冰晶分子的形成 以免对细胞造成伤害 2 加入1ml细胞悬液于冻存管中 在火焰下将安瓿封口 密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期 可用带有18G针头注射器进行分装 如剂量过大 保护剂对细胞渗透作用不匀 冷冻效果不好 3 加保护剂的细胞悬液经缓慢冷冻 结冰产生在细胞外 对细胞没有损伤 如果要长期保存 可以使用液氮罐 4 冻结好的安瓿放入低温冰柜或液氮罐中 温度达 150 190 细胞几乎处在停止状态 冷冻时带手套操作 以免冻伤 慢冻程序 标准程序 当温度在 25 以上时 1 2 min当温度达 25 以下时 5 10 min当温度达 100 时 可迅速放入液氮中 缓慢冷冻的简化程序 配置冷冻保护液 在培养液中加入血清 一般20 10 甘油或DMSO 将冷冻液加入离心管 使细胞浓度为2 6 106cell ml 将冷冻液分装到冷冻管中 4 冰箱放置30 60min 20 冰箱放置2小时 冷冻管放入泡沫盒或用棉花纱布包裹 70 冰箱放置1 2天 投入液氮罐 取旺盛生长的细胞 消化后用离心管离心回收细胞 在没有程序控制冻存器设备的条件下 将冷冻管 管口要朝上 放入纱布袋内 纱布袋系以线绳 通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口 按每分钟温度下降1 2 的速度 在40分钟内降至液氮表面 停30分钟后 直接投人液氮中 196 液氮罐 普通冰箱 低温冰箱 解冻程序 原则 快速解冻原因 解冻缓慢时 原有冰晶溶化后 又会以新的晶核为中心形成更大的冰晶 称为水的重结晶现象 但采用快速解冻可避免水分的重结晶减少冰晶损伤 解冻程序 从液氮中取出冷冻管 快速放入37 40 水浴中 轻轻震摇 使冻存细胞尽快解冻 40 60s 玻璃化冷冻 原则 快速冷冻原因 从理论上讲 只要获得足够快的降温速度 任何液体都可以进入玻璃化状态 例如 要是纯水进入玻璃化状态 降温速度需高达1010 s 以现在的条件没办法达到 解决办法 通过添加高浓度的冷冻保护剂 可以显著降低形成玻璃化所要求的降温速度 一般冷冻保护剂的浓度为40 60 冷冻保护剂 DMSO 乙酰胺 丙二醇 聚乙二醇等 玻璃化冷冻的程序 配置冷冻液 在平衡盐溶液 Hanks 中加20 5 DMSO w v 15 5 乙酰胺 w v 10 丙二醇和10 聚乙二醇 以单核细胞为例 取旺盛生长的细胞 消化后用离心管离心回收细胞 并将离心管置于冰浴中 将预冷的冷冻液缓慢地滴加到离心管中 使细胞浓度为1 1 5 106cell ml 滴加的速度先慢后快 具体过程如下 前3分钟以0 3ml min滴加 后5分钟以0 6ml min滴加 余下的以0 75ml min滴加 将含有细胞的冷冻液分装到冷冻管中 将冷冻管投入液氮 196 液氮罐 解冻程序 从液氮中取出冷冻管放入冰浴中5min 使其融冻 转移到离心管 并放入冰浴中 将已在冰浴中预冷的含20 血清的Hanks液对细胞冻存悬液稀释 稀释过程要缓慢 具体过程如下 前10分钟0 2ml min速度滴加 接下来10分钟以0 5ml滴加 接下来的15分钟以0 75ml min滴加 最后30min以1ml min滴加 离心回收细胞 弃