IGY提纯与鉴定.doc

试 验 抗日本血吸虫卵黄抗体的制备与鉴定材料与方法1.1主要试剂正辛酸 天津市弗晨化学试剂厂 批号200101（分析纯）硫酸铵 天津市四通化工厂（分析纯）3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB） Amresco批号T2007/10二甲基亚砜（DMSO） 郑州化学试剂厂 批号20030224十二烷基磺酸（SDS） 北京鼎国生物技术公司 Sigma进口分装 L5750丙烯酰胺 沃德赛斯生物技术有限公司Sigma进口分装A8887羊抗鸡IgY（FITC标记） Promega公司 低分子量标准蛋白质 中科院上海生物化学研究所 DAB Amresco C069DTT Genview DH116-21.2 试剂的配制1.2.1 提取蛋白用试剂的配制（1）饱和硫酸铵溶液 (NH4)2SO4 760g，蒸馏水（5080） 1000mL搅拌溶解20分钟，趁热过滤冷却后以浓氨水（NH3H2O）调PH至7.07.4，配制好的饱和硫酸铵置4处置30 min以上，瓶底应有结晶析出，用时应置室温平衡后再用。（2）醋酸缓冲液（0.06M,pH4.8）醋酸钠 4.082g冰乙酸 1.815g（约1.7 mL ）1.2.1 ELISA用试剂（1）包被液（0.05M pH9.6 碳酸钠缓冲液）无水Na2CO3 1.59gNaHCO3 2.93g 蒸馏水加至1000 mL（2）洗涤液（0.01M pH7.4 磷酸盐缓冲液）PBSTNaCL 8.0g KCL 0.2gKH2PO4 0.2gNa2HPO412H2O 2.9g吐温-20 0.5mL 蒸馏水加至1000 mL（3）封闭液（1% BSAPBST）牛血清白蛋白（BSA） 1g 洗涤液 PBST 100mL（4）底物缓冲液（pH5.0 柠檬酸-磷酸缓冲液）0.1M柠檬酸 (19.2g/L) 24.3mL 0.2M Na2HPO4 (28.4g/L) 25.7mL蒸馏水 50mL（5）TMB底物使用液TMB储存液（100mg溶于10mLDMSO,4保存） 100L底物缓冲液 10mL30%H2O2 10L （临用新鲜配制）（6）终止液（2M H2SO4）H2SO4（96%） 22.2mL蒸馏水 177.8mL1.2.3 SDS-PAGE电泳用试剂(1)10%（w/v）SDS溶液十二烷基硫酸钠（SDS） 10g蒸馏水 100mL （室温保存）(2)10%（w/v）过硫酸铵（AP）过硫酸铵 1g蒸馏水 10mL （临用前新鲜配制, 4保存1周）（3）30%丙烯酰胺混合液丙烯酰胺 29.2g二甲基双丙烯酰胺 0.8g 蒸馏水定容至100mL，棕色瓶4贮存（4）分离胶缓冲液（1.5M pH8.8Tris-HCl）Tris 18.2g少量蒸馏水溶解HCl（1M） 调pH至8.8 蒸馏水定容至100mL，4贮存（5）浓缩胶缓冲液（1.0M pH6.8Tris-HCl）Tris 12.1g少量蒸馏水溶解HCl（1M） 调pH至6.8 蒸馏水定容至100mL，4贮存（6） 2LeammLi样品缓冲液10%SDS 4 mL甘油 2 mL1.0M pH6.8Tris-HCl 2.8 mL（7）电极缓冲液（10）Tris 30.3g甘氨酸 144.2g十二烷基硫酸钠（SDS） 10g 蒸馏水定容至1000mL，使用时10稀释（8）染色液（0.25%（w/v）考马斯亮蓝R-250酸甲醇水染液）考马斯亮蓝R-250 1.25g甲醇 227mL冰醋酸 46mL蒸馏水 227mL（9） 脱色液（酸甲醇水脱色液）甲醇 50mL冰醋酸 75mL蒸馏水 875mL1.3 耗材及主要仪器自动双重纯水蒸馏器 上海亚荣生化器厂SZ-93型台式电子天平 北京赛多利斯Acculab紫外可见分光光度计 UV-2102倒置显微镜 日本Nikon超声裂解仪 Cole-Parmer Instrument公司自动酶联检测仪 Anhos Labtee Instruments Gmbh公司台式离心机 北京医用离心机厂 LD5-2A型96孔酶标板 江苏海门公司垂直电泳槽 北京六一仪器厂电泳仪（DYY-5） 北京六一仪器厂手动可调式移液枪 大龙医疗设备（上海）有限公司荧光显微镜 日本OLYMPUS 1.4 方法1.4.1鸡群的免疫 已做过1.4.2 检测鸡群卵黄抗体水平的间接 ELISA方法的建立70717273 间接ELISA程序按常规方法在96孔聚丙乙烯微量板上进行。以日本血吸虫可溶性抗原按一定稀释倍数包被板子；0.05%的PBS-Tween20（PBST）液洗涤6次，1min每次；1%的BSA-PBST封闭，洗涤同上；加入待测卵黄液样品，37孵育；同上洗涤后加入酶标记兔抗鸡IgG，37孵育；洗涤后加入新配制的四甲基联苯胺（TMB）底物溶液，室温显色；2M的H2SO4终止反应，酶标仪上测定各孔450nm处的吸光值（OD450nm）。1.4.5.1 抗原最适包被稀释度的确定 将抗原用包被液（0.01M，pH9.6碳酸盐缓冲液）作1:50始倍比稀释包被酶标板，采集未免前鸡蛋为阴性卵黄作1:100 1:500 1:1000 1:2000稀释，四免后第15 d收集鸡蛋为阳性卵黄作1:1000 1:2000 1:4000 1:8000稀释，加入最佳工作浓度的酶标二抗，按间接ELISA方法进行，测定各孔OD450nm值 ，方阵法确定抗原最适包被浓度和抗体的最佳稀释度。1.4.5.2 抗原最适包被时间和温度的确定 将稀释的C.baileyi可溶性抗原以不同的方式包被，分别以4过夜（10 h），37孵育2h、10h后，加入阴阳性血清，按间接ELISA方法测定。1.4.5.3 特异性试验 阻断试验：将阳性鸡抗血吸虫卵黄液作1:1001:1600稀释，每个稀释度加入等量稀释度的血吸虫可溶性抗原，37孵育阻断30min后，再进行ELISA测定，同时设相应对照，比较结果。类属反应：对3份阳性鸡贝氏隐孢子虫卵黄样品按前述方法处理后进行ELISA测定，同步设血吸虫阳性卵黄、阴性卵黄作对照。1.4.5.4 重复性试验 选择5份鸡抗血吸虫卵黄液样品在不同时间、相同条件下重复作ELISA测定，每个样品重复3次，比较试验结果。1.4.5.5 试验样品的检测试验 分别采集实验组和对照组4免后第15 d卵黄样品各3份，用间接ELISA方法进行效价测定。1.5 IgY抗体的收集纯化与测定 1.5.1 IgY抗体的分离纯化 1.5.1.1 IgY抗体的粗提取免疫后所产高效价鸡蛋清洁消毒后，打破蛋壳，弃蛋壳、蛋清及卵黄衣膜，获得卵黄液（约10L/枚）与灭菌单蒸水（D.W）按1：9稀释，充分搅拌混匀，调PH值至5.15.4，置4，6h以上或过夜，滤纸过滤上清，去除最上层漂浮的卵黄脂质后，离心10min（10,000rmin-1，4），弃沉淀，获取上清液，即为粗提的IgY抗体。1.5.1.2 IgY抗体的体纯参照相关文献666768以酸化水稀释-盐析法，用不同的盐类和浓度收集纯化卵黄中的IgY抗体。卵黄的预处理同IgY抗体的粗体，以粗体的卵黄抗体进一步以盐析法纯化。设置五种盐析法提纯IgY抗体，方法如下： 方案1：水稀释一步硫酸铵盐析法，上述卵黄预处理上清，加入33%饱和硫酸铵，搅拌均匀，4作用2h以上，离心（10,000rmin-1，410min），弃上清，沉淀溶于原卵黄液体积的PBS（0.01M,pH7.4）中，置常规处理过的透析袋中，流水透析过夜，次日以1：1000以上的PBS搅拌透析，3h左右换液一次，透析3d，获抗体蛋白，加入1000U/L的双抗，-20冷藏备用。方案2：水稀释二步硫酸铵盐析法，上述预处理上清，加入50%饱和硫酸铵，搅拌均匀，4作用2h以上，离心（10,000rmin-1，410min），弃上清，以适量体积的PBS溶解沉淀，加入33%饱和硫酸铵，同上离心，获取沉淀溶于原卵黄液体积的PBS中，置超滤管3500rpm离心25min，获抗体蛋白，加1000U/L的双抗，-20冷藏备用。方案3：水稀释二步硫酸钠盐析法，上述预处理上清，加入19%硫酸钠（W/V），搅拌均匀，4作用2h以上，离心（10,000rmin-1，410min），弃上清，以适量体积的PBS溶解沉淀，加入14%硫酸钠（W/V），同上离心，获取沉淀溶于原卵黄液体积的PBS中，置透析袋中，同上透析，获抗体蛋白，加1000U/L的双抗，-20冷藏备用。方案4：水稀释一步硫酸钠盐析法，上述预处理上清，加入19%硫酸钠（W/V），45水浴，充分搅拌2h左右，离心（10,000rmin-1，410min），弃上清，沉淀溶于原卵黄液体积的PBS中，置透析袋中，同上透析，获抗体蛋白，加1000U/L的双抗，-20冷藏备用。方案5：水稀释辛酸硫酸铵盐析法，上述预处理上清，加入3倍体积（0.06M,pH4.8）醋酸缓冲液，并调pH 值至4.5，上述处理的样品搅拌下缓慢加入正辛酸，30L /L样品，继续搅拌30 min以上，置4充分作用2h左右，离心（10,000rmin-1，410min），弃沉淀，收集上清，10份上清加入1份PBS（0.02M,pH7.4），调pH 值至7.4，搅拌下加入33%饱和度的饱和硫酸铵溶液，继续搅拌30 min以上，离心（10,000rmin-1，410min），弃上清，沉淀溶于原卵黄液体积的PBS中，置透析袋中，同上透析，获抗体蛋白，加1000U/L的双抗，-20冷藏备用。1.5.2 IgY抗体的纯度测定 用SDS-PAGE方法，比较不同盐析方法纯化抗体所达到的纯度。参照文献6169分别配制8%分离胶，5%浓缩胶，装入电泳仪，浓缩胶电压40V，当染料前沿进入分离胶后，将电压提高到80V，染料前沿到达距分离胶底部1cm时关闭电源，置考马氏亮兰R-250染色液，室温染色4h或过夜，转至脱色液中脱色，至凝胶背底透明，蛋白条带清晰，判读结果并拍照后，置保存液4保存。1.5.3 纯化IgY抗体的蛋白质浓度测定 紫外分光光度计测所提取IgY抗体的蛋白含量，计算各种提纯方法提取的蛋白含量。1.6 IgY抗体的鉴定1.6.1 IgY抗体的效价测定收集卵黄从1：1000开始作倍比稀释，按建立的ELISA方法测定免疫不同时间的卵黄抗体效价。1.6.2 IgY的SDS-PAGE分析参照相关文献6169进行，配制5%的浓缩胶，8%分离胶，装入电泳设备，加入不同方法提纯的IgY抗体样品、未提纯前样品、低分子标准蛋白样品以及鸡血清IgG作对照，起始压为80V，待样品前沿至分离胶时调电压为130V，电泳样品距胶底lcm处停止电泳，置室温下考马斯亮蓝R-250染色液，染色4 h或过夜，脱色液充分脱色，至呈现出清晰蛋白条带，判读结果并拍照后，置保存液4保存。2. 结果与分析2.1 2.3 ELISA检测方法 2.3.1 抗原、抗体最适包被稀释度经反复冻融和超声波破碎获得的C.baileyi可溶性抗原，以紫外分光光度计测得蛋白质浓度为18.6mg.mL-1，2.3.2 抗原最适包被温度和时间37孵育2h、10h，加入底物系统后显色较差，结果判定不明显。4（10h）包被过夜后，阴性吸光值较低，可降低本底显色，减少假阳性率，结果显示更为准确、灵敏。因而选择4（10 h）包被过夜为最佳包被条件。表4. 最适包被抗原、抗体的工作浓度选择Tab.4 . The selection of coating dilution in ELISA 鸡卵黄液稀释度dilution of yolk抗原包被浓度（dilution of antigen）1：50 1：100 1：200 1：4001:100()0.5090.3930.2870.2441:1000()1.0100.9630.9170.8971:500()0.2130.1780.1240.1131:2000()0.9420.8850.8300.8021:1000()0.1590.1290.0980.0791:4000()0.9260.8240.7120.6581:2000()0.1080.0920.0820.0661:8000()0.8220.7010.6020.497表5. ELISA最佳包被时间的确定Tab.5 . The selection of coating time in ELISA 稀释倍数(dilution of positive yolk)1:500 1:1000 1:2000 1:16000 1:64000 1:512000阴性对照1:500Negative yolk(1:500)4过夜1.8481.8041.0700.7040.4890.1670.10637孵育2h0.7700.5420.4370.4180.4110.4320.38737孵育10h0.8630.6220.4930.4450.4130.4050.362表6 卵黄不同处理方法的样品检测OD值Table6. The OD value of the different processing to yolk sample稀释倍数1:5001:10001:40001:160001:640001:512000阴性(1:500)PBS法1.7652.0361.9521.9031.7840.8130.434BSA-PBST法1.6811.9631.9261.7491.4210.6740.105D W 法1.7601.7961.9081.7871.6710.8500.4112.3.3 不同卵黄前处理对ELISA检测的影响同一份收集的卵黄液样品，分别以PBS处理法、1% BSA-PBST处理法和D.W处理法，进行逐级倍比稀释，按ELISA方法测定OD450nm值。由表6可见PBS法、BSA-PBST与D.W法抗体检测结果没有明显的差异，但BSA-PBST法检测结果显色效果好，梯度明显，阴性吸光值较低。由于BSA-PBST法简单、省时，无须进行卵黄稀释4沉降，因此，在检测卵黄抗体水平时采用1% BSA-PBST溶液直接稀释待检卵黄液进行ELISA测定。2.3.4 特异性试验测定结果血吸虫可溶性抗原与将阳性卵黄液进行阻断试验时，各稀释度的阳性卵黄抗体效价明显降低，其OD值与阴性对照接近（见图7）；对3份阳性鸡法氏囊卵黄样品和3份鸡新城疫-传染性支气管炎卵黄样品ELISA检测结果均为阴性，表明该检测方法具特异性。 2.3.5 重复性试验 5份阳性鸡抗C.baileyi卵黄液样品在不同时间、相同条件下重复作ELISA测定结果见表7，由表可知批内变异系数为1.85%10.49%，批间变异系数为3.22