生物信息学论文 胡小鹏.doc

深圳大学考试答题纸(以论文、报告等形式考核专用)二 一 一 二 一 二 学年度第 2 学期课程编号23222005课程名称生物信息学主讲教师苏庆宁李凌云买制刚评分学 号姓名专业年级2012级生物医学工程（医）教师评语：题目：小鼠肿瘤坏死因子启动子荧光素酶表达载体的构建摘要：利用NCBI genebank数据库及genetool软件设计引物，克隆小鼠TNF-启动子序列，将其插入荧光素酶表达载体pGL3-basic中。将经过鉴定的重组载体pGL3-TNF-promoter转染巨噬细胞264.7，应用萤光素酶检测系统检测其活性。1.查找启动子序列：打开NCBI的Map viewer网站，网址/mapview/index.html，输入要查询的TNF-，得如下结果：再点击右下方quick filter 勾上gene选项，找到TNF-alpha基因所在染色体上的位置：点击17号染色体上的Genes seq（注：下边的几个序列也是一样的，一般选第一个即可）出现如下信息：点击，Download/View Sequence/Evidence，查看基因序列：Sequence Format 选择Genebank 形式，再点击Display,出现：目的基因的相关序列以及信息。可知转录位点从基因1956位开始转录，由于内含子的存在，所以mRNA在DNA上序列上分成了几段。promoter位于转录起始位点上游约2000bp区域，启动子序列为：2. 引物设计用NCBI查出小鼠TNF-的基因的CDS：打开网站：/NEBcutter2/index.php，查询在这段开放阅读框内0 cutter的酶，并结合结合实际情况，使用列表中的Xho 、HindIII作为引物酶。 用genetool软件设计引物：Forward PrimerName: TNF- deg 1-21 Len:21 Score:76*Predicted Melting Temperature: 58 degrees CelsiusGeneTool Score: 76Start: 1 End: 21 Length: 21Bases: 5CCAATTCTCGAGGTTTTCCGAGGGTTGAAT 3Reverse PrimerName: TNF- deg 1934-1956 Len:23 Score:74*Predicted Melting Temperature: 51 degrees CelsiusGeneTool Score: 74Start: 1934 End: 1956 Length: 23Bases: 5CCATAAAGCTTGAGGGAGATGTGGCGCCT 3上游引物P1 5端加入Xho酶切位点（CTCGAG）即5CTCGAGCCCAATTCTCGAGGTTTTCCGAGGGTTGAAT 3下游引物P2 5端加入HindIII酶切位点（AAGCTT）即5AAGCTTCCATAAAGCTTGAGGGAGATGTGGCGCCT3请外面引物公司合成，扩增基因片段长度为：233bp。3. 基因组DNA提取按组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒说明提取小鼠基因组DNA。-20保存备用。4. 目的片段的扩增以基因组DNA为模板，用上游和下游引物扩增TNF-启动子DNA序列。用genetool软件模拟电泳结果：MWM:DNA marker 1:PCR产物，大小为233bp 图1。TNF-启动子序列PCR产物5.TNF-启动子荧光素酶表达载体的构建及鉴定回收产物的电泳条带，用试剂盒对PCR产物进行纯化。Xho和Hind分别双酶切扩增的TN-F启动子和载体pGL3basic，琼脂糖凝胶分离酶切产物，AXYGEN胶回收试剂盒回收和纯化目的片段。T4 DNA连接酶连接pGL3-basic和TNF-片段过夜，转化感受态细菌JM109，接种含IPTG和X-gal的Amp+LB培养皿培养。取阳性克隆菌酶切、测序。重组体命名为pGL3-TNF-promoter。用genetool软件模拟双酶切电泳结果：MWM:DNA marker 1:重组质粒pGL3-TNF-promoter 图2.限制性内切酶双酶切图6.基因测序结果：7.转染及荧光素酶活性检测实验组将pGL3-TNF-promoter+pRL-SV40（转染效率内参），对照组pGL3-basic+pRL-SV40分别用脂质体Lipofectamine 2 000瞬时转染巨噬细胞264.7。实验组、对照组各24孔。转染36 h后，按照双荧光素酶检测试剂盒（Dual Luciferase Assay System）的操作说明处理转染细胞，并通过GloMax 20/20发光检测仪测萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶的荧光值，将两者的比值，作为衡量荧光素酶活性的依据。Reference:1. LIU B.Construction and identification of human puma promoter luciferase report gene vectorJ.Medical Journal of National De-fending