生物化学实验十一 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测.doc

实验十一 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子质量一、目的要求学习和掌握采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子质量的基本原理和方法。二、 实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合交联形成的三围网状结构。通过改变单体Acr浓度或单体与交联剂的比例可以控制凝胶孔径的大小，这取决于两个重要的参数T和C，其中T是两个单体（Acr和Bis）的总百分浓度，C是与总浓度有关的交联百分浓度。T=（a+b）/m100(%) C=b/(a+b)100(%)式中，a为Acr质量（g）；b为Bis质量（g）；m为水或缓冲液的终体积（mL）。聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续的和不连续系统两种。在连续系统中，电泳槽中缓冲液的pH与凝胶中一致，而在不连续系统中上述两者的pH不相同，不连续系统的分辨率较高。从凝胶形式上可分为柱式或板式。将凝胶装于垂直的玻璃管中进行电泳分离称柱式电泳，此法制备凝胶方便，样品需要量少，凝胶条便于长期保存；板式电泳的优点是可以在同一凝胶板上同时检测盒比较多个样品，在平板电泳的基础上还建立了分辨率更高的双向电泳。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统具备三种效应，因此大大提高了分辨率。(1)浓缩效应：在电泳开始时，样品在浓缩胶与分离胶界面上形成了高度压缩的薄层，作为在分离胶中进一步分离的起始样层，有时甚至能浓缩几百倍。(2)电荷效应：蛋白质混合物在界面处被高度浓缩，形成一狭小的高浓度的蛋白质区带。由于每种蛋白质分子所带的电荷不同，因而泳动率不同，各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的蛋白质区带。(3)分子筛效应：当蛋白质分子通过浓缩胶进入分离胶时，颗粒小、呈球形的样品分子移动快，柯利达、形状不规则的分子在通过凝胶空洞时的阻力大，移动就缓慢。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同的蛋白质分子的主要极力为上述的电荷效应和 分子筛效应，即这些分子所带净电荷的差异和分子质量大小的不同。如果将净电荷差异这一因素除去，那么蛋白质分子在凝胶上的泳动率则完全取决于分子质量。SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，当加入到电泳系统中就能使蛋白质中的氢键、疏水键打开，并在一定条件下以1.4:1（质量分数）的比例结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素。于是根据标准蛋白质分子质量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子质量。本实验采用不连续体系进行SDS柱状电泳，测定蛋白质分子质量。三、 材料、器材和试剂1材料：植物材料2器材：(1)圆盘电泳槽(2)电泳仪(3)小玻管(4)小橡皮塞(5)培养皿和竹夹子(6)长针头及普通针头(7)注射器(8)微量注射器(9)细长皮头滴管(10)洗耳球(11)小试管架(12)胶布(13)记号笔(14)恒温箱3试剂：(1)丙烯酰胺单体储液（Acr29%，Bis0.9%）(2)分离胶缓冲液储液(3)浓缩胶缓冲液储液(4)样品缓冲液储液(5)前沿指示剂(6)样品缓冲液(7)10%过硫酸铵(8)10%SDS(9)核黄素溶液(10)电极缓冲液(11)脱色液(12)染色液4、 实验步骤凝胶电泳一般可分为三个步骤：制胶、电泳、检测。4.1制胶(1)取十二支玻管，一段用胶布封上，橡皮筋扎好。在距管另一端1cm和2cm处用记号笔做好记号。(2)配制分离胶30ml(Acr10%,T=10%,C=3%)。有两种配制方法：光照聚合和化学聚合。配制方法如表所示。分离胶的制备试剂光照聚合化学聚合单体储液1010分离胶缓冲液储液7.57.5双蒸水101210%SDS0.30.3四甲基乙二胺（TEMED）/L1010核黄素2.210%APS0.2总体积30.0130.01核黄素和10%APS最后加入，APS和TEMED的量可根据室温和聚合情况而定。(3)配好分离胶后，混匀，用滴管加到玻管内第一个记号处，加双蒸水封面。化学聚合的管放入温箱，大约1h后即可凝固，刚加水时可看出有界面，以后逐渐消失，不久又出现界面，表明凝胶已经聚合。光照聚合的管放在光照下大约1h后可以凝固。(4)配制浓缩胶（Acr3.9%，T=4%,C=3.3%)：两种配制方法：光照聚合或化学聚合。配制方法如表所示。浓缩胶的制备试剂光合聚合化学聚合单体储液2.62.6浓缩胶缓冲液储液2.42.4双蒸水13.314.810%SDS0.20.2四甲基乙二胺（TEMED）/L1010核黄素1.510%APS10总体积20.0120.02核黄素和10%APS最后加入。APS和TEMED的量可根据室温和聚合情况而定。配好浓缩胶后，混匀，从分离胶胶面移去覆盖水后，迅速将此胶加到分离胶上面玻管第二个标签记号处。再小心加一层覆盖水，把光照聚合或化学聚合管分别放到光照下或温箱中，放置1h，胶凝结后应于1h内使用（光照聚合和化学聚合任选一种进行）。4.2电泳(1)标准蛋白质处理：称取标准品细胞色素C（CytC）、牛血清白蛋白（BSA）各0.02g于试管中，加入1ml样品缓冲液，在沸水浴中加热5min后，于3000r/min离心5min，取上清液即为标准蛋白液。(2)待测植物样品的处理：取一定量的植物蛋白提取液，加入1ml样品缓冲液，在沸水浴中加热5min后，于3000r/min离心5min，取上清液即为待测样品液。(3)加样：把浓缩胶上的水层倒掉，去掉下端胶布。在每管浓缩胶上面加100L各标准蛋白液或待测样品液。(4)玻管两端剩余空间用电极缓冲液注满，注意不得产生气泡，不搅动样品。(5)电泳：上下两电泳槽分别注满电极缓冲液，上槽连接负极（黑色），下槽连接正极（红色）。接通电源后，电流按每管8mA计，稳流不稳压。当溴酚蓝移动到接近凝胶底部时，断电停止电泳。4.3检测(1)剥胶：将凝胶玻管从电极槽上取下。取一支带长针头的注射器注满水，将针头从浓缩胶一端小心地插入到管壁和凝胶之间，转动玻管，同时推动注射器，并使针头在管壁和凝胶间前进。此时注入水，使胶条在水的压力及润滑作用下从玻管中脱出。也可用洗耳球在玻管一端使劲打气，将胶条挤出玻管。为防止电泳带扩散，剥胶操作应迅速。(2)固定及染色：将脱出的胶条迅速置于培养皿内，倒入染色液，固定并染色1h（染色液可回收）。(3)脱色和保存：考马斯亮蓝R-250染色后的凝胶，用水冲去表面染料，放入脱色液中浸泡，经常更换脱色液直到背景几乎无色为止，大约第二天即可显出蛋白条带。凝胶可在7%醋酸中长期保存。五、结果处理(1)计算迁移率：测量由凝胶柱顶端至溴酚蓝和蛋白质色带的距离(cm)，按下式计算相对迁移率(Rf)。 Rf=蛋白质移动距离（cm）/溴酚蓝移动距离（cm）(2)作图：当蛋白质相对分子质量在12000200000时，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性相关关系。lgMw=-bRf+K式中，Mw为分子质量，Rf为相对迁移率，b为斜率，K为常数。以标准蛋白质相对分子量的对数为纵坐标，以相对迁移率为横坐标作标准曲线。根据样品蛋白质的相对迁移率可从标准曲线上查出其相对分子质量的对数，然后再换算成样品蛋白质的相对分子质量。实验结果：(1)标准品细胞色素C（CytC）相对迁移率=Rf1=3.1/6=0.52牛血清白蛋白（BSA）相对迁移率=Rf2=1.2/5=0.24碱性磷酸酶相对迁移率=Rf3=1/5.8=0.176、 讨论(1)制胶时注意不能产生气泡，加水覆盖勿扰动胶面。(2)Acr和Bis的原液会由于水解作用而形成丙烯酸和NH3。若将溶液装在棕色瓶中于4冰箱储存能部分防止水解，但也只能储存12个月。可用测pH的方法来检查是否失效。失效溶液不能聚合。(3)Acr和Bis是神经性毒剂，