生物技术制药.doc

二生物制药：泛指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物，或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用做诊断和治疗疾病的医药品。生物技术制药：采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品的技术。生物药物：指运用生物学，医学，生物化学等的研究成果，从生物体，生物组织，细胞，体液等综合利用物理学，生物学，生物化学，生物技术和药学等学科的原理和方法制造的一类用于预防，治疗和诊断的制品。包括生物技术制药和原生物制药。细胞因子：在体内或体外对效应细胞的生长、增殖和分化起调节控制作用的一类物质，化学本质主要是蛋白质和多肽；细胞因子可以促进受损组织的恢复，对正常组织无作用。激素是调节机体正常发育和活动的重要物质是由一类动物体内腺体细胞和非腺体组织细胞所分泌的化学信息分子；激素主要有：蛋白质类激素 多肽类激素 氨基酸衍生物激素 脂类激素珠磨法：将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度的破碎化学渗透法：使用一些可以改变细胞壁或膜的通透性的化学试剂，使细胞内物质有选择地渗透出来的方法膜分离法：是利用膜的选择性分离实现料液的不同组分的分离、纯化、浓缩的过程超滤：根据溶质分子和悬浮粒子是否通过多孔膜来进行筛分，即利用一种特制的膜，对溶液中的各种溶质分子进行选择性过滤反渗透：以高分子透过性薄膜为分离介质，在超过溶液渗透压力的情况下，使溶液中的溶剂透过薄膜，同时使溶质和不溶物阻截在膜前，即溶剂从高浓度一侧传递到低浓度一侧的渗透方法微孔滤膜：由高分子材料制成的薄膜过滤介质，可以过滤一般介质不能截留的细菌和微粒超精密过滤：以聚乙烯醇为主体的中空多孔滤膜，分级性能在超滤膜和微孔滤膜之间，用于水的精制、循环水的净化、除悬浮固体粒子以及糖液酶液的精制。电渗析：电渗析是基于离子交换膜能选择性地使阴离子或阳离子通过的性质，在直流电场的作用下使阴阳离子分别透过相应的膜达到从溶液中分离电解质的目的。双水相体系：两种天然的或合成的亲水性聚合物水溶液相互混合，由于较强的斥力或空间位阻，相互之间无法渗透，在一定条件下即可形成双水相体系反向胶团：是表面活性剂分子溶于非极性溶剂中自发形成的聚集体，其中表面活性剂的极性分子头朝内而非极性头朝外与有机溶剂接触，反胶团溶液是宏观上均一透明的热力学稳定体系。医药生物技术三大类药物：生物 化学 中药生物药物来源：人体 动植物 微生物 各种海洋生物生物药物的药理学特性: 治疗的针对性强 药理活性高 毒副作用小、营养价值高 生理副反应常有发生生物药物四种分类方法：结构 来源 生理功能和用途 生物制药的研究内容按生物工程学科范围分为： 发酵工程制药 基因工程制药 细胞工程制药 酶工程制药生物药物原料选择原则：选择有效成分含量高，原料新鲜，来源丰富易得，产地较近，原料中杂质含量少，成本低，环境友好型材料生物药物提取时组织与细胞的破碎方法：磨切法 机械破碎法 压力法 反复冻融法 超声波震荡破碎法 自溶法或酶解法蛋白质类药物分离提取方法：沉淀法（盐析 有机溶剂 等电点） 按分子大小分离（超滤 透析 层析 离心） 电荷（离子交换 层析 电泳 等点聚焦 ） 亲和层析法（酶与底物 抗原与抗体 激素与受体）核酸类药物的分离提取方法：提取法 发酵法 糖类药物的分离提取方法从含有一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖： 非降解法从组织中提取一种结合比较牢固的粘多糖： 降解法（酶解）人体来源药物的特点：1. 安全性好，不易产生副反应2. 效价高，疗效可靠 质量好，效价高3. 稳定性好人血液成分制品：全血制品 血液成分制品 血浆成分制品 体液细胞内成分制品血液成分制品包括：红细胞 白细胞 血小板 血浆（通过离心和过滤的方法得到）红细胞制剂：适用于需要提高血液携氧能力和补充血红蛋白，而又不需要补充维持血容量，是心脏病，慢性肾病和肝病患者补充血红蛋白的首选品种，对骨髓功能衰竭性贫血，术前和术后需要补充血红蛋白者都十分有效白细胞浓缩液：肿瘤病人经细胞药物治疗后，处于骨髓细胞抑制期间遭受感染且各种抗生素治疗无效时采用血小板制剂：白血病，淋巴瘤及其他肿瘤因治疗而导致的骨髓抑制症状。血小板可促进止血和加速凝血，其还有营养支持作用是维护毛细血管壁的完整性血浆中除水之外，主要成分是蛋白，即白蛋白和球蛋白血浆蛋白主要有：传输蛋白类 免疫球蛋白 凝血系统蛋白 补体系统蛋白 蛋白酶抑制物类 人体液细胞包括红细胞，白细胞，淋巴细胞，血小板，成纤维细胞等；活性物质主要有干扰素 白介素-2 超氧化物歧化酶人体中分离的白蛋白主要有两种：从健康人血中分离的人血清白蛋白和从健康产妇胎盘中分离的胎盘白蛋白植物中天然有机化化合物种类：糖和糖苷类 苯丙素类 醌类 黄酮类 鞣类 萜类 甾体 生物碱 植物糖类药物：单糖类 聚糖类 糖的衍生物 植物脂类药物（按化学组成和结构）：脂肪和脂肪酸类 磷脂类 固醇类胰岛素的性质：有两条多肽链通过二硫键连接，A链21个氨基酸，B链30个氨基酸海洋生物取得重要进展的领域海洋生物抗癌活性物质 海葵 海兔 海绵海洋生物抗菌活性物质 海洋细菌中提取出海洋生物抗心血管疾病活性的物质 喹啉同类可增强心肌收缩能力、抗心律失常海洋生物抗放射性活性物质及酶类 超氧化物歧化酶海洋前列腺素海洋保健品 螺旋藻海洋医用生物材料 憋试剂 河豚毒素试剂 甲壳素 珊瑚我国发展海洋药物的主攻方向海洋生物活性物质的研究大力促进海洋生物技术在开发海洋药物上的应用开发新的海洋中成药和新剂型充分利用海洋资源，开发海洋保健品开发新的海洋医用生物材料三生物药物提取和纯化主要步骤：预处理 固液分离 浓缩 纯化 产品定型原料选择基本原则1.选择合适的目标原料2选择有效成分含量高的新鲜材料3来源丰富易得4.制造工艺简单易行5.成本比较低6.原材料的采集不破坏生态环境，选择对环境友好的原材料资源，防止生物入侵细胞破碎机械法：珠磨法 高压匀浆法 超声波破碎法 X-press法非机械法：酶溶法 化学渗透法 冻融法 干燥法机械法是最常用的方法，速度快，处理量大，不会带入其他化学物质，但处理过程中会产生热量，必要时要采取冷却措施，以防止目的产物的失活。高压匀浆法原理：利用高压使细胞悬浮液通过针型阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂超声波破碎法原理：空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞破碎酶溶法原理：利用酶反应，分解细胞壁上的特殊键化学渗透法化学试剂及原理1. 表面活性物质：使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞破碎2. EDTA螯合剂：与结构中Ca2+或Mg2+螯合，使其原有结构破坏而破裂3. 有机溶剂：能被细胞壁中的类脂吸收，使细胞膜溶胀，导致细胞破碎4. 变性剂：与水中氢键作用，减弱水的极性，使疏水性化合物溶于水化学渗透法优点：1. 选择性释放产物2. 细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取缺点：1. 通用性差，某种试剂只能作用于某种特定类型的细胞2. 时间长，效率低3. 有些化学试剂有毒反复冻融法：将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次达到破壁作用反复冻融法原理：冷冻使细胞膜的疏水键结构破坏，亲水性能上升；胞内水形成冰晶粒，剩余胞质盐浓度上升，外水进入，细胞溶胀破裂反复冻融法特点：只适用于细胞壁较脆弱的菌体；破碎率较低；冻融种可能引起某些蛋白质变性离心原理：巨大的离心作用使悬浮的小颗粒以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离 沉降的速度取决于颗粒的质量、大小和密度离心可分为：差速离心法 速度区带离心法 等密度离心法膜分离法：超滤 反渗透 微孔滤膜 超精密过滤 渗析 电渗析 膜分离法原理：利用天然或人工合成的具有选择透过性的薄膜，以及外界能量或化学位差为推动力，对双组分或多组分体系进行分离，分级，提纯或富集。膜分离设备：板框式组件 卷式膜组件 管式膜组件 中空纤维膜组件板框式组件：优点：组装方便，膜的清洗更换比较容易，料液通流截面较大，不易堵塞，同一设备可根据生产需要而组装不同数量的膜缺点：需密封的边界线长盐析法优点：设备和条件要求低，安全应用范围广，高盐情况下，蛋白质不易发生变化，一般在室温下操作缺点：分级分离能力不高盐析时注意问题：1. 盐饱和度：蛋白质结构和性质不同，盐析要求的饱和度也不同2. PH：蛋白质在PI时溶解度最小，进行盐析时，要选择在被分离蛋白质的PI附近3. 蛋白质浓度：相同条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐的饱和度也越低，但蛋白质浓度越高，与其他蛋白质的共沉淀作用也越强。选择适当的蛋白质浓度，可避免共沉淀干扰4. 温度：室温下，浓盐对蛋白质有保护作用，但对温度敏感，因此要在低温下进行5. 盐析沉淀物的脱盐：盐析的沉淀分离后，经脱盐才能获得纯品，常用透析法有机溶剂沉淀法原理：不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异分离目的蛋白质。蛋白质的沉淀与溶解与溶剂的介电常数有关，降低溶液的介电性常数使其溶解度变小，同时还破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀析出。有机溶剂沉淀应注意问题1. 控制工艺过程低温恒温2. 缓慢搅拌，防止溶剂局部分温度过高3. 及时处理沉淀物，降低有机溶剂浓度4. 选择PH在待沉淀蛋白质的PI附近5. 有机溶剂是酶和蛋白质的变性因素，尤其对敏感酶类双水相萃取工艺流程：目的产物的萃取 PEG循环 无机盐的循环 双水相萃取技术特征：1. 体系有生物亲和性2. 体系能进行萃取性的生物转化3. 体系能与细胞相结合，操作既节省萃取设备和时间，又避免了保内酶的损失。4. 亲和萃取可大大提高分配系数和萃取专一性5. 任何两相体系，都不要求特殊的处理就可以与后续纯化工艺相衔接6. 开发廉价新型的双水相体系反胶团萃取原理：蛋白质进入反胶团溶液是一个协同过程。在有机溶剂相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层同邻近的蛋白质分子发生静电吸引而变形，接着两界面形成含有蛋白质的反胶团然后扩散到有机相中，从而实现蛋白质的萃取。改变水相条件（PH、离子种类、离子强度），又可使蛋白质从有机溶剂中返回到水相中。反相萃取优点：成本低、选择性高、操作方便、放大容易、萃取剂（反胶团相）可循环利用、蛋白质不易变性影响反胶团萃取因素：表面活性剂 水相PH 离子强度 温度 蛋白质分子量和浓度用AOT反胶团体系萃取血红蛋白时发现，蛋白质浓度高时，萃取效率降低；蛋白质浓度低时，萃取率高超临界流体萃取分离过程的原理是利用超临界流体的溶解能力与其溶解密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界流体状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。超临界流体优点（与化学法相比）1. 可以在接近室温（3540）及CO2气体笼罩下进行提取，有效地防止热敏性物质的氧化和逸散2. 使用SFE是最干净的提取方法，100%的纯天然3. 萃取和分离合而为一，不仅萃取效率高而且能耗少，节约成本4. CO2是一种不活泼的气体，萃取过程中不发生化学反应，安全性好5. CO2价格便宜，纯度高，易获得，能循环使用，降低生产成本6. 通过改变温度或压力达到萃取的目的，萃取速度快层析法离子交换层析影响交换速度的因素：树脂颗粒的大小 搅拌和流速 离子浓度 离子的水化半径 树脂酸碱的强弱和溶液PH 交联度大小 有机溶剂影响 凝胶层析常用凝胶：葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶 疏水性凝胶电泳：带电颗粒在电场作用下发生迁移的过程电泳按其分离的原理不同分为：区带电泳 自由界面电泳 等速电泳 等点聚焦电泳电泳按其支持介质的不同分为：纸电泳 醋酸纤维薄膜电泳 琼脂凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩是指低浓度溶液通过除去溶剂变为高浓度溶液的过程结晶是利用某些药物具有形成晶体的性质，目标药物（溶质）从溶液中析出呈晶态的过程结晶的条件：1. 纯度 各种物质在溶液中均达到一定的纯度才能析出结晶2. 浓度 结晶液的浓度较高，利于分子间的碰撞聚合，但浓度过高，相应杂质和溶液的粘度增大，反而不利于结晶3. PH 选择PH在PI附近，有利于晶体析出4. 温度 低温条件进行，活性物质不易变性，又可避免细菌繁殖5. 时间 结晶的生成和生长需要时间，但时间也不宜过长 6. 晶种 不宜结晶的药物常加晶种诱导干燥：从湿的固体生物药物中，除去水分或溶剂而获得相对或绝对干燥制品的工艺过程 干燥分为：常压干燥 减压干燥 喷雾干燥 冷冻干燥四基因工程药物和制剂主要是医用活性的蛋白和多肽类，包括免疫性蛋白 细胞因子 激素 酶类基因工程技术生产药品优点：1. 利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障2. 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围3. 可以发现、挖掘更多内源性生理活性物质4. 内源性活性物质作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和除去5. 可以获得新型化合物，扩大药物筛选来源基因工程药物制造的主要程序：目的基因的克隆 构建DNA重组体 将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌 工程菌的发酵 外源基因表达产物的分离纯化 产品的检验 基因工程医药产品都是活性肽或蛋白质，这些产品的制得具有以下特点：1. 目的产物在初始物料中含量较低2. 含目的产物的初始物料组成复杂3. 目的产物的稳定性差4. 种类繁多5. 应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热原等含目的产物的起始物料的特点：1. 菌种类型及代谢特性2. 原材料和培养基的来源及其质量3. 生产工艺和条件4. 初始物料的物理、化学和生物学特性基因工程药物分离纯化的技术要求：1. 技术条件要温和，能保证目的产物的生物活性2. 选择性好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高的纯化倍数3. 收率较高4. 两个技术之间要能直接相衔接，不需要对物料加以处理或调整，减少工艺步骤5. 整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求基因工程药物分离纯化工艺应遵循原则：1. 具有良好的稳定性和重复性2. 尽可能减少组成工艺的步骤3. 组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺与设备也能互相适应，从而减少步骤之间对物料的处理和条件调整4. 在工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化的步骤或干扰产品质量5. 分离纯化工艺时间要尽可能短6. 工艺和技术都必须高效，收率高，易操作，对设备条件要求低，能耗低7. 具有较高的安全性基因工程药物质量控制主要包括：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性产品的保存液态保存方法：低温保存、在稳定PH条件下保存、高浓度保存、加保护剂保存固态保存：固态蛋白质比液态稳定，一般蛋白质含水量超过10%时容易失活，含水量降到5%时，在室温或冰箱中保存均比较稳定基因表达是人们关心的问题主要有：目的基因的表达产量 表达产物的稳定性 产物的生物学活性 表达产物的分离纯化用于目的基因表达的宿主细胞：原核细胞 真核细胞原核细胞：大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 链霉菌 （链霉菌：不致病、使用安全、分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力）真核细胞：酵母 丝状真菌 哺乳动物细胞表达载体必须具备的条件：1.能够独立自我复制2.具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 3.具有很强的启动子 4.具有阻遏子 5.具有很强启动子 6.具有翻译起始信号基因工程药物研究中常用的表达载体：pBV220系统 PET系统影响目的就基因在大肠杆菌种表达因素：1. 外源基因的拷贝数2. 外源基因的表达效率（启动子的强弱 核糖体结合位点的有效性 SD序列和起始密码AUG的间距 密码子的组成）3. 表达产物的稳定性4. 细胞的代谢负荷5. 工程菌的培养条件来源于真核细胞的药物基因在大肠杆菌中的表达方式：融合蛋白的形式 非融合蛋白的形式 分泌型表达蛋白 1. 融合蛋白真核基因在大肠杆菌中表达的简便方法是使其表达为融合蛋白的一部分，该融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，这样的蛋白质是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的，故称融合蛋白表达融合蛋白优点：基因操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定，不易被细菌酶类所降解，容易实现高效表达；缺点：只能做抗原用，融合蛋白中含有一段原核多肽序列，可能会影响真核蛋白的免疫原性，一般不能作为人体注射用药2非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含任何细菌多肽序列；因此，表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：细菌启动子 细菌的核糖体结合位点（SD序列） 真核基因的起始密码 结构基因 终止密码 3. 分泌型表达蛋白外源蛋白的分泌表达是通过将外源基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的下游来实现的特点：一些可被细胞内蛋白酶所降解的蛋白质在周质中是稳定的；有些蛋白质能按一定的方式折叠，在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌表达时却具有活性；蛋白质信号肽和编码序列之间能被切割，因而分泌后的蛋白质产物不含起始密码AUG所编码的甲硫氨酸；但可能会出现产量不高，信号肽不被切割或不在特定位置上切割等酵母细胞表达系统包括：载体 启动子等控制序列 宿主细胞 载体：YEP 类（酵母附加体质粒） YRP类（酵母复制型质粒） YcP类（酵母着丝粒质粒） YIp类（酵母整合型质粒）影响目的基因在酵母菌中表达的因素： 外源基因的拷贝数； 外源基因的表达效率（启动子 分泌信号的效率 终止序列的影响）； 外源蛋白的糖基化； 宿主菌株的影响；工程菌质粒不稳定（多是分裂不稳定）产生的原因：含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率 这两种菌的比生长速率差异大小提高质粒稳定性的方法1.选择合适的宿主菌 2.选择合适的载体 3.选择适当的压力（选择合适的抗生素） 4.分阶段培养、分阶段控制 5.控制培养条件 6.固定化五细胞工程：应用细胞生物学和分子生物学等学科理论和技术，按照人们的需要，有计划、大规模地培养生物组织和细胞以获得生物及其产品，或者通过改变细胞的遗传组成以产生新的种或品种，为社会和人类提供需要动物细胞工程包括：细胞培养技术（包括组织培养、器官培养）； 细胞融合技术；胚胎工程技术（核移植、胚胎分割等）；克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆、个体克隆）植物细胞工程包括：植物组织、器官培养技术；细胞培养技术；原生质体融合与培养技术；亚细胞水平的操作技术目前诱导细胞融合的方法：病毒 聚乙二醇 电激酶工程：酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化的应用现代酶工程的主要内容：1. 酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用和开发2. 酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应检测3. 酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究4. 酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究5. 有机相中酶反应的研究6. 酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究7. 抗体酶、核酸酶的研究8. 模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究酶工程制药主要包括：药用酶的生产和酶法制药药用酶指可用于预防和治疗疾病的酶药用酶：治疗消化不良的蛋白酶、治疗白血病的L-天冬酰胺酶、用于防护辐射损伤的超氧化物歧化酶、用于抗菌消炎的溶菌酶、用于治疗心肌梗塞的尿激酶药用酶生产方法主要有：药用酶的发酵生产、药用酶的分离纯化、药用酶的分子修饰酶法制药指利用酶的催化作用而制造出具有药用功效的物质的技术过程酶法制药技术主要包括：酶的催化反应、酶的固定化、酶的非水相催化药用酶的生产方法：提取法 生物合成法 化学合成法用于酶的发酵生产的细胞必须具备的条件：1.酶的产量高 2.容易培养和管理 3.产酶的稳定性好 4.利用酶的分离纯化 5.安全可靠 提高药用酶产量的措施：1.添加诱导物 2控制阻遏物浓度 3添加表面活性剂 4.添加刺激剂 5.添加产酶促进剂药物的酶法生产中，选择适当前提物（原料）、酶及其反应条件的依据：1. 根据欲制造药物的结构和特点，选择好原料、反应步骤及所使用的酶或酶系2. 根据药物的用途和要求，选择的酶需经过一定步骤进行纯化，以达到产品要求3. 根据酶的反应动力学特点，确定并优化反应条件，包括底物浓度、酶浓度、温度、PH值、激活剂的浓度4. 要求前体物质达到一定的纯度要求并廉价易得，以提高产品质量，降低生产成本酶的不足之处：稳定性较差，易失活；难以回收重复利用；酶反应后与产物混合在一起，给纯化带来困难固定化酶：指限制或固定于特定空间位置的酶。具体地说，是指经过物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂固定化酶优点：1. 可以多次利用，多数情况下，酶稳定性提高2. 酶与底物和产物易于分开，易于纯化，产品质量高3. 反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制4. 酶的利用效率高，单位酶催化的底物数量增加，用酶量减少5. 比水溶性酶更适合于多酶反应 酶的固定化方法：载体结合法（物理吸附法、离子结合法、共价结合法）； 包埋法（网格型、微囊型） 交联法载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的一种固定方法物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的一种固定化方法离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性的载体上的固定化方法共价结合法：酶以共价键结合于载体上，也就是将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应集团进行共价结合的方法交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法网格型：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中固定化使用载体需符合条件：1.固定化过程中不引起菌变性 2.对酸碱有一定的耐受性 3.有一定的机械强度 4.有一定的亲水性及良好的稳定性 5.有一定疏松网状结构，颗粒均匀 6.共价结合时具有可活化基团 7.有耐受酶和微生物细胞的能力 8.廉价易得酶和细胞的固定化载体：吸附载体 包埋载体 共价结合载体 微囊化包埋技术：是将酶定位于具有半透性膜的微小囊内的技术，包有酶的微囊半透膜厚约20nm ，膜孔径40nm左右，其表面积与体积比很大，包埋酶量也很多。其基本制备方法有界面沉降法和界面聚合法界面沉降法：本法是物理法，利用某些在水相和有机相界面上溶解度极低的高聚物成膜的过程将酶包埋的方法。 其基本