生物显微技术实验指导.doc

实验一 石蜡切片技术取材、包埋一、实验目的掌握制作石蜡切片中取材、包埋的基本操作技术。二、实验用品1、实验材料：鱼2、实验试剂：10%甲醛溶液（40%甲醛10ml，蒸馏水90ml）、50%酒精、70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精、二甲苯、石蜡。3、实验器具：解剖器，双面刀片，小瓶，牛皮纸、电热恒温箱、脱水机、包埋机。三、实验步骤1、取材：用任何杀生的方法把鱼杀死，将腹腔打开，切取0.5cm3左右大小的肝脏、肠等组织。2、固定：将切好的组织直接投入10%甲醛固定液中，固定24h。3、脱水：50%酒精70%酒精80%酒精90%酒精95%酒精100%酒精100%酒精。每级1-2h。70%酒精处可长期保存。4、透明：1/2二甲苯+1/2100%酒精 (1-2h) 纯二甲苯(1h) 纯二甲苯(1h)5、浸蜡：石蜡先置于60的温箱中，倒入含二甲苯及材料的小瓶中置于37温箱中，放置2-4小时。6、包埋：先提升恒温箱的温度至60，换纯蜡3次，每次1-2h，用牛皮纸叠纸盒，置于45-60的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。四、作业分析总结石蜡切片技术中固定和包埋的操作注意事项有哪些？附：折纸盒按下列顺序折叠：(1) 折AA及BB；(2) 折CC及DD；(3) 折CE与AE、向外夹出EE。同样折出FF，GG及HH；(4) 使CEE与EIE两三角形相叠，并沿EC和EI重叠的折痕向后转折。同样折其余三只角；(5)折RIJF向外，同样折出GKLH，即折成所需的纸盒。实验二 石蜡切片技术切片、贴片一、 实验目的掌握制作石蜡切片中切片、贴片的基本操作技术。二、实验用品：1实验试剂： 95%酒精、100%酒精、二甲苯、明胶液、蒸馏水。2实验器具：切片机、展片机、烤片机、载玻片、盖玻片、酒精灯、毛笔、牛皮纸、刀片、解剖刀、台木。三、实验步骤：1修块、粘块、整修的步骤：（1）选取所要切片的材料，从包埋的石蜡块上用单面刀片切割下来，注意不可损伤包埋的组织。（2）确定切面的方位，用刀片将石蜡块的四面作初步的整修。保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。（3）点燃酒精灯，并准备一把旧的解剖刀。（4）左手大拇指与食指间持整修好的石蜡块，材料向上用其余三指夹住台木。此时将解剖刀在酒精灯上加温后，即放在台木与石蜡块之间，因解剖刀已加温，遇上两面的石蜡都会融化，可立即将解剖刀抽出，石蜡块迅速压在台木上。（5）再将解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，放在刚才固定的石蜡四周。此时，解剖刀再加温，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平。使石蜡块牢固地粘在台木上。（6）修石蜡块上下面平行，使切成的蜡带呈一直线，不弯曲。每个切片中组织的距离接近。2切片的方法：（1）准备下列用具：毛笔、牛皮纸（2）将已固着和整修好的石蜡块和台木装在切片机的夹物部分.（3）安装切片刀，将刀片夹在刀夹上，并调整好刀的角度。刀的斜度，非常重要，最好先切除的蜡块试刀，以确定刀的斜度，一经调度适合后，就不要随便变动，以免每次试刀的麻烦。（4）移动刀片固定器，使夹刀部与夹物部之间的距离调整好，以石蜡块的表面刚贴近刀口为度，在旋紧切片固定器的螺旋。（5）调整石蜡块与刀口之间的角度与位置。修整蜡块，将刀片移近蜡块，使小蜡块的下边与刀锋平行，如不平行，可调夹物部上的螺旋。然后把它固定，再转下蜡块呈矩形才行。只有平整的蜡块，才能切出平整的蜡带。（6）最后根据需要，调整控制切片厚度的机制。调度后，把它固定下来。上述四步骤完成后，就可进行切片，（7）开始切片。右手握旋转轮的手柄，摇动一转就可切下一片，切下的蜡片粘在刀口上，待第二片切下时粘在一起，所以连续摇动就可将切下的蜡片连成一条蜡带。这时左手就可持毛笔将蜡带提起，边摇边移动蜡带。转速为每分钟40-50为宜。（8）切成的蜡带到20-30厘米时，即以右手用另一只毛笔轻轻将蜡带挑起，平放在牛皮纸上。靠刀的一面较光滑，应向下，较皱的一面向上。（9）切下的蜡片是否良好，此时应先行检查。（10）切片工作结束后，仍将刀片用具擦拭干净。3贴片：贴附牢固，在染色时不易脱落；使皱褶的蜡片伸展平整。用具：载玻片、粘片剂、解剖刀、蒸馏水、展片机及烤片机。材料切成薄片后，须将切片粘在玻璃片上，加热展开，这叫粘片。所用载玻片必须清洁才能使用。粘片时，需把胶液置簿玻片上，再取切片，浮置胶液上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度3040约1小时即干。 （1）将展片机温度调整到35，保持恒定。（2）在载玻片上涂蛋白甘油粘片剂。其法是用细玻璃棒蘸取一小滴粘片剂，加在载玻片的中央，然后用洗净的手指（无名指）加以涂抹，范围不要太广，也不要太多，以能贴足够的蜡片为度。（3）将涂粘片剂的载玻片放在展片机上，滴加蒸馏水数滴，此时若发现水不均匀分散而聚成滴状，即表示玻片不清洁，有残留油脂等物在上面。（4）用解剖刀将蜡带切成小段，每段的长度应以盖玻片的长度为准，一般应比盖玻片短约1/5-2/5。分片应从蜡带交界处分。将蜡带轻轻移到涂有水的载玻片上，蜡片光面应向下贴在载玻片上，依次排列整齐。留出右端贴标签处。（5）材料展平后，从展片机上取下，稍稍倾斜留出多余的水分，用吸水纸吸干背面及周围多余水分，放于烤片机（35）上烤干水分。保存在玻片盒内。四、作业分析总结石蜡切片技术中切片和贴片的操作注意事项有哪些？实验三 石蜡切片技术染色、观察一、 实验目的掌握制作石蜡切片中苏木精伊红（HE）染色法及其结果的观察。二、实验用品1、实验试剂：二甲苯、酒精、苏木精染液、伊红染液、树胶。苏木精原液配方：苏木精（2g），冰醋酸（10ml），甘油（100ml），95%酒精（100ml），蒸馏水（100ml），硫酸铝钾（5g），配制步骤：1.将苏木精溶于少量酒精中，加冰醋酸后搅拌，加速其溶解；2.加入甘油及其余酒精；3.研碎钾矾，溶于水中并加温；4.将加温的钾矾溶液一滴滴地加入染色剂中，并不断搅动；5.瓶口用双层纱布包扎，放于通风处，并经常摇动，直到颜色变为紫红时即可使用，成熟时间约需2-4周以致数月之久，若加0.2g碘酸钠即可立即成熟。已成熟的原液，须用瓶塞密封，置低温暗处长期保存。使用时以原液1份加入50%酒精与冰醋酸等量混合液1份或2份。伊红溶液配方：伊红（1g）、70-75%酒精（100ml）。配制步骤：先将伊红用蒸馏水(少许)调成浆糊状，再加入酒精，边加边搅拌，直到彻底溶解，此时试剂有些混浊，取少许冰醋酸，加入到试剂中去，试剂逐渐转变为清亮，呈鲜红色，。 2、实验器具：染缸、显微镜。三、实验步骤1、二甲苯脱蜡：把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中纯二甲苯(5-10min) 纯二甲苯(5-10min)2、二甲苯与纯酒精等量混合液2min。3、纯酒精、95%、70%、50%、30%酒精 各2min。4、蒸馏水2min。5、苏木精染液15-20min。6、蒸馏水洗，去除多余染液。7、1%酸酒精分化数秒钟（如染色合适，此步可取消）8、自来水洗数秒至1min。9、氨水中“蓝化”数秒，或在自来水中冲洗使变蓝。10