生物分析技术期末考试609.docx

色谱联用第一，色谱-质谱联用一质谱法的特点：1.被分析的样品首先要离子化。2.通过测定样品离子质荷比（m/z）来进行定性定量分析。3.质谱是分子离子及碎片离子的质量与其相对强度的谱, 谱图与分子结构有关；4.质谱法可提供分子量, 确定分子式。5.质谱法进样量少, 灵敏度高, 分析速度快；二质谱仪的结构：质谱仪是通过对样品电离后产生的具有不同的 m/z 的离子来进行分离分析的。质谱仪包括：1进样系统: 进样系统的作用是高效重复地将样品引入到离子源中并且不能引起真空度的降低。进样方式： 1）直接进样;2）仪器联用的进样（GC、LC、CE）2电离系统：离子源的作用是使样品分子变成离子，将离子聚焦，并加速进入质量分析器。 质谱检测的是离子；离子源即为接口。离子化方式：1） 电子轰击电离 Electron Impact Ionization EI （应用最广泛）a)原理: 由GC或直接进样杆进入的样品，以气体形式进入离子源，由灯丝发出的电子与样品分子发生碰撞使样品分子电离。b)特点： 所有的标准质谱图都是在70 eV下做出的。而一般有 机化合物的电离电位是10 eV。 有机物分子可能被打掉一个电子形成分子离子，确定 化合物分子量；也可能会发生化学键的断裂形成碎片 离子，得到化合物的结构信息。 2）化学离子化 Chemical Ionization CI a) 有些化合物稳定性差，用EI方式不易得到分子离子，这时采用CI电离方式。CI源工作过程中要引进一种反应气体。气体经过电子轰击，产生离子，再与试样相互碰撞，产生准分子离子。b)特点: 最强峰为准分子离子； 谱图简单； 不适用难挥发试样。3）电喷雾电离 Electrospray Ionization ESIESI是一种软电离方式，即便是分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，它适合于分析极性强的有机化合物。ESI最大特点是容易形成多电荷离子。 可以测量大分子量的蛋白质。 4）场电离，场解吸 Field Ionization, Field Desorption FI、FD a) 特点： 强电场将分子中拉出一个电子； 分子离子峰强； 碎片离子峰少； 不适合化合物结构鉴定。b)局限性：要求样品分子处于气态，灵敏度不高，应用逐渐减少。5）快原子轰击 Fast Atom Bombardment FAB （主要用于磁式双聚焦质谱仪）a)氩气在电离室依靠放电产生氩离子，高能氩离子经电荷交换得到高能氩原子流，氩原子打在样品上产生样品离子。电离过程中不必加热气化，因此适合于分析大分子量、难气化、热稳定性差的样品。b) 缺点：混合物样品中共存物质的干扰，它们常常会抑制分析物的离子化，造成灵敏度下降甚至根本没有信号产生。6）基质辅助激光解析电离 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization MALDI （适用于生物大分子）MALDI可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。 待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。7）大气压化学电离 Atmospheric Pressure Chemical Ionization APCIAPCI喷嘴的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+ 和O+ 等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子化。 APCI主要用来分析中等极性的化合物。 APCI主要产生的是单电荷离子，很少有碎片离子，主要是准分子离子。可以认为APCI是ESI的补充。 3.质量分析系统：质量分析器是质谱仪的核心, 质量分析器的作用是将离子源产生的离子按m/z顺序分开并排列。 不同类型的质量分析器构成不同类型的质谱仪:1） 单聚焦磁场分析器 离子进入分析器后，由于磁场的作用，其运动轨道发生偏转改作圆周运动。在一定的B、V下，不同m/z 的离子其R不同，由离子源产生的离子，经过分析器后可实现质量分离。2） 四级杆质量分析器 只有质荷比满足要求的离子才能通过四级杆到达检测器。其它离子则撞到四级电极上而被“过滤”掉。四极杆质谱结构简单，价廉，体积小，易操作，扫描速度快， 适合于GC-MS, LC-MS，但分辨率不高。3） 离子阱质量分析器 特定m/z离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器；4） 飞行时间质谱仪 m/z小的离子，漂移运动的速度快，最先通过漂移管; m/z大的离子，漂移运动的速度慢，最后通过漂移管。 适合于生物大分子， 灵敏度高，扫描速度快， 结构简单，分辨率随m/z 的增大而降低。 5）傅立叶变换离子回旋共振质谱仪FT-MS的核心为分析室，分析室由三对平行的极板构成。磁力线沿z轴方向，离子的回旋运动垂直于z轴，在与x轴方向垂直的两极板上施加激发射频，在与y轴方向垂直的两极板上检测信号。4.检测系统：质量分析器分离并加以聚焦的离子束，按m/z的大小依次通过狭缝，到达收集器，经接收放大后被记录。质谱仪的检测主要使用电子倍增器，也有的使用光电倍增管。 倍增器出来的电信号经计算机处理后可得到色谱图，质谱图等信息。三气相色谱-质谱联用仪1.GC-MS接口技术接口的作用：1）.除去载气；2）.将待测物毫无损失地从GC转移至MS。评价参数：1）. 传输产率Y； 2）. 浓缩系数N; 3）. 延时t ； 4. 峰展宽系数H目前常用的GC-MS接口：1）直接导入型（最常用）：将毛管直接插入质谱仪的金属毛细管内。毛细管色谱柱流出的载气和待测物进入离子源作用场。由于惰性气体He不发生电离，只有待测物分子形成带电粒子，在加速电场作用下进入质量分析器。特点：结构简单，易维护，应用广泛。2）开口分流型; 特点：色谱柱出口常压、接口简单 在色谱流量较大时，传输能力较低，不适用于填充柱条件 3）喷射式分离器特点：分离除去绝大部分载气，使试样组分浓集，同时达到低真空度。 适用于填充柱或毛细管柱与较小功率的抽真空质谱仪联接。 2. GC-MS总离子色谱图总离子色谱图的横坐标是出峰时间, 纵坐标是峰高。 图中每个峰表示样品的一个组份,由每个峰可以得到相应化合物的质谱图。 峰面积和该组份含量成正比,可用于定量。 3.GC-MS选择离子质谱图 SIM主要用于定量分析。 只有特定质量数的离子被检测。 根据目标化合物选择合适的检测离子相当重要。 灵敏度取决于所选择的检测离子。 四液相色谱-质谱联用仪1.LC-MS中存在的问题：LC 流动相对MS工作条件的影响 1ml溶剂气化生成 500 1300ml的蒸气。而 质谱仪只能接受10 ml/min。 气体流量有时流动相中含难以挥发的缓冲盐。 2. 质谱离子源温度、电离方式不适宜液相色谱所分析的样品。 2.LC-MS的接口 接口作用：除去流定相，只让组分分子进入离子源。直接液体导入接口（DLI） 移动带技术（MB） 热喷雾接口（TS） 粒子束接口（PB） 快原子轰击（FAB） 基质辅助激光解吸（MALDI） 电喷雾电离（ESI） 大气压电离（API） 大气压化学电离（APCI） 3.识别分子离子峰必须是谱图中最高质量的离子。 必须是奇电子离子。 必须能够通过合理的离子碎裂机理产生谱图中的一些重要离子。 氮规则：一个化合物含有偶数个氮原子，其分子离子的质量数一定是偶数；一个化合物含有奇数个氮原子，其分子离子的质量一定是奇数。 五毛细管电泳-质谱联用1.CE-MS的接口 接口技术是实现CE-MS联用的关键所在。近几年来，关于CE-MS方法学的研究主要是关于新接口技术。目前主要分为： CE-ESI-MS接口技术：1）鞘液接口 ；2）无鞘液接口鞘液体接口技术：金属接口（喷雾杆）具有三层套管结构：内层中插入多孔毛细管, 中间层采用了液体鞘流技术, 鞘液从中间层流出, 与毛细管中流出的液体混合, 解决了毛细管末端电接触的问题, 同时可以控制鞘液体流速以增大进入ESI的液体量，补给足够的液体基质, 形成稳定的电喷雾。鞘液接口技术的优点在于通过提高样品流速使得喷雾更加稳定,有利于形成稳定的电流回路,同时可改变CE运行缓冲液的组成,使其满足ESI源的检测要求。然而鞘液的引入会稀释样品, 使检测灵敏度下降。为此,有人设计了低流速鞘液接口，以降低鞘液的稀释作用, 同时铂丝构成电流回路可以避免因流速低所造成的断流。2.CE-ICP-MS接口技术 ICP-MS是一种先进的痕量多元素分析技术。CE-ICP-MS具有分离分析速度快、灵敏度高、分辨率高、样品用量少等优点, 在金属及金属化合物的分离分析中扮演着重要的角色。 目前主要有3种CE-ICP-MS接口技术: 无鞘液接口技术 鞘液接口技术 氢化物发生接口技术优点：CE-MS 在线联用具有样品损失少、自动化程度高、分析速度快等优点,其应用要比离线联用广泛。 缺点： a.离子源受限，仅电喷雾等几种方法可选。 b.常不允许CE采用其最佳缓冲条件，限制其优势的发挥。 c.CE出峰很快，没有时间进行二级质谱测定。 CE-MS的局限性CE/MS的应用报道虽然很多,但作为常规方法尚存在以下缺点: 灵敏度低,不如LC-MS；毛细管壁涂层材料中的表面活性剂等会降低被分析物的离子化效率甚至严重污染MS离子源；不是所有的CE分离模式都可方便地用于与MS相联用； MS对CE分离缓冲液的限制较多。 第二色谱-福利叶变换红外光谱联用（FTIR）一GC-FTIR1.红外光谱原理：红外光谱根据不同的波数范围分为三个区： 近红外区 13,3304000 cm-1（0.752.5 m） 中红外区4000650 cm-1（2.515.4 m） 远红外区 65010 cm-1（151000 m）分子沿重心轴转动的能量为转动能；二个以上原子连接在一起，它们之间的键如同弹簧一样振动，所需能量为振动能。 当分子受到红外光的辐射，如果分子中某个基团的振动频率和它一样，二者就会产生共振，此时光的能量通过分子偶极距的变化而传递给分子，这个基团就吸收一定频率的红外光，产生振动跃迁，形成红外吸收光谱。2.GC-FTIR概述u质谱一般难于区分同分异构体，单凭MS确定有机物结构有时很困难，甚至不可能。 实现GC-IR的困难 除了工作气压匹配之外，其余工作条件的差异很大。尤其是散射型红外光谱仪，扫描速度和灵敏度远远低于色谱。 FTIR的出现大大促进了GC-IR的发展。FTIR具有光通量大、信噪比好、扫描速度快等优点，与GC的匹配性大大提高。 3.GC-FTIR系统接口装置：光管: GC/FTIS的关键部件。 用硼硅玻璃制成； 两端装有KBr盐窗，红外干涉光可以通过； 内壁镀金，有高的反射率，红外干涉光在其中多次反射，增加光程以提高灵敏度； 可加热，保证GC流出物不在此冷凝、聚集； 适当的容积，以获得最佳分辨率和灵敏度。 细内径短光管 有助提高分辨率 长光管 有助提高灵敏度 4 GC-FTIR提供的信息：（1）三维实时显示红外光谱图（2）化学图 (官能团色谱图 ) 指定官能团频率范围对时间所作的图； 是一个“色谱图”，每个峰代表一个组分； 包含的信息比一般的色谱图多，体现了化合物类型或所含的官能团； 与GC-MS中的质量色谱图作用相似。 （3）红外重建色谱图 GC-FTIR采集的数据经计算机处理后得到的红外吸收信号对时间所作的图。 积分吸收重建图(红外总吸光度重建图 TIA)，相当于GC-MS中的总离子流图(TIC)。不能实时检查。 Gram-Schmidt重建色谱图 扣除了载气背景的积分重建图。 二.LC-FTIR1.LC/FTIR接口流通池接口工作原理： 首先经液相色谱分离的馏分随流动相顺序进入流通池，同时FTIR同步跟踪，依次对流通池进行红外检测，然后对获得的流动相与分析物的叠加谱图作差谱处理，以扣除流动相的干扰，获得分析物的红外光谱图，进而通过红外数据库进行计算机检索，对分析物进行快速鉴定。特点： 装置简单、操作方便。 局限性： a)流动相的干扰难以彻底消除；b)不适合梯度淋洗技术；c)被测物在池内受检时间受色谱峰出峰时间限制而无法 采用信号平均技术提高红外谱图的信噪比等。 因此，流动池法的应用受到了限制，最理想的办法是在测定光谱前去除流动相。2.LC/FTIR接口流动相去除接口流动相去除接口是在测定红外光谱之前将通过物理或化学方法将流动相除去以排除溶剂的干扰。目前已报道的该类接口有许多种，最具有实际意义的有雾化接口、漫反射转盘接口等。正相色谱：（1）漫反射转盘接口 工作原理： 由色谱柱出来的流出物首先经过一个加热管，使90%的流动相挥发除去，浓缩的样品滴入装有细KBr或KCl粉末的样杯，若干个样杯装在一个转盘上，由微机控制其转动。特点：灵敏度高， 但只适用于分析沸点高且有UV吸收的物质。因水难去除，仅适用于正相色谱。（2）连续雾化接口 工作原理： 色谱流出物流入雾化器被直接喷雾在装有金属轴的NaCl晶体窗片上，然后溶剂立即被蒸发除去，而溶质则以微粒结晶析出。然后以FTIR检测窗片上的流出物。特点： 常温下分离溶剂，适用于不易挥发而易热分解的有机化合物。反相色谱：（1）连续萃取式漫反射转盘接口 工作原理： 首先将含水流动相与萃取剂二氯甲烷混合，经萃取管后，流出物分为水相和有机相，密度小的水相被吸气瓶吸去，有机相部分被导入样品浓缩器，进而滴入漫反射转盘上的样品杯。特点：常温下分离溶剂，适用于不易挥发而易热分解的有机化合物。（2）热雾化接口 工作原理： 由HPLC出来的流出物被加热雾化在光管内壁上，用多次反射光谱法测定光管壁上附着的溶质。此装置有四个一样的光管，依此收集、测量、清洗和干燥。如此反复。 特点：能有效除去溶剂，但灵敏度不高。3.LC/FTIR两种接口比较流动相去除法的缺点：与流动池法相比，流动相去除法的接口装置复杂，且操作需一定经验。流动相去除法的优点：1. 无流动相干扰，可使用多种流动相；2. 适用于梯度淋洗，提高了样品的分离检测能力； 3. 当进行离线红外检测时，可使用信号平均技术，增加谱图的信噪比，检出限一般较流动池接口低。第三.色谱-原子光谱联用一.GC与原子光谱联用技术1为什么将GC和原子光谱联用？ 金属元素存在不同的形态和价态，其毒性相差较大。 利用色谱将不同价态和形态的微量元素进行分离，然后再用原子光谱进行测定。 2联用“接口”的作用色谱与原子光谱的“接口”就是要在不降低色谱分离性能的前提下将色谱分离后的组分尽可能多的送入到原子光谱的原子化器中使之原子化，同时不降低原子化器的原子化效率。基态：在无外来作用时，原子中各电子都尽可能处于最低 能级，从而使整个原子的能量最低，原子的这种状 态称为基态。 激发态：当原子受到外来作用时，它的一个或几个电子吸 收能量后跃迁到较高能级，从而使原子处于能量 较高的新状态，此状态称作激发态。 激发：原子由基态跃迁到激发态的过程叫做激发。 退激：激发态是一种寿命极短的不稳定状态，原子随即 跃迁回基态，这一过程叫做退激。原子发射光谱： 原子从某一激发态跃迁回基态，发射出具有一定波长的一条光线，而从其它可能的激发态跃迁回基态以及某些激发态之间的跃迁都可发射出波长不同的光线，这些光线形成一个系列（谱），称为原子发射光谱，简称原子光谱。 原子吸收光谱： 将一束白光通过某一物质，若该物质中的原子吸收其中某些波长的光而发生跃迁，则白光通过物质后将出现一系列暗线，如此产生的光谱称为原子吸收光谱。 等离子体（Plasma）在近代物理学中，是指一种在一定程度上被电离的气体，其中电子和阳离子的浓度处于平衡状态，宏观上呈电中性的物质。电感耦合等离子体ICP：是由高频电流经感应线圈产生高频电磁场，使工作气体形成等离子体，并呈现等离子体焰炬，达到10000K的高温，是一个具有良好的蒸发-原子化-激发-电离性能的光谱光源.二. LC与原子光谱 联用技术LC-FAAS液相-火焰原子吸收光谱最简单的联接方法是用一根低扩散蛇形管作为接口三.色谱-核磁共振波谱联用1.色谱-核磁共振波谱联用普及的原因核磁共振的方法与技术作为分析物质的手段 ，由于其可深入物质内部而不破坏样品 ，并具有迅速、准确、分辨率高等优点而得以迅速发展和广泛应用 ，已经从物理学渗透到化学、生物、地质、医疗以及材料等学科 ，在科研和生产中发挥了巨大作用 。 高效液相色谱是分析复杂有机物、药物和生物大分子等混合物的一种重要手段，但紫外、荧光、电化学等检测器只能得到非常有限的分子结构信息。 NMR能够提供大量的分子结构信息，但NMR分析方法要求样品为纯品，对于复杂的混合物，因为NMR信号的互相覆盖，单纯靠NMR谱则显得无能为力。 在核磁仪器前加上一级色谱分离设备把直接样品分离后再送人NMR中扫描，就可以大大简化分析程序，提高样品分析速度，这就是色谱分离技术与NMR波谱仪结合并且日趋普及的原因。2.HPLC-NMR联用装置典型的HPLC-NMR联用装置是由泵、注入阀、色谱柱和紫外检测器组成LC系统，通过一条22 .5m长的特制毛细管连接到NMR液相探头上。可以将NMR 视为HPLC 的特殊检测器，其化学位移、积分强度和谱线分裂情况能提供丰富的定量定性信息。3.NMR探头是联用装置中最关键的部分。传统的NMR探头样品管在一个与测量线圈相连的玻璃插件内旋转。 HPLC-NMR探头由一个不旋转的直接固定在射频线圈上的玻璃管构成，它处于传统探头玻璃杜瓦瓶的中心，玻璃管内径为2，3或4 mm。玻璃壁长度至少超过质子检测线圈(18 mm)，并与之平行，同时向两端逐渐变细。4.运行模式（1）在流运行模式 在流运行模式是将HPLC的输出直接连接到1H NMR的检测池，连续检测HPLC的洗脱液。 1H NMR成为HPLC的检测器。（2）直接停留模式：（停留运行模式 ）通过UV检测器确定了色谱峰位置之后，准确得知欲测组分到达 1H NMR检测池的时间。一旦欲测组分到达检测池，立即将HPLC泵停止，使色谱峰准确地停留在NMR检测池中进行检测。 主要缺点是：由于色谱流动相阶段性停止，大大增加了分离时间，从而可能会使色谱峰展宽，分辨率下降。（3）环存储运行模式： （停留运行模式）在色谱分离的过程中，将各个色谱峰的一部分转移到不同毛细管中然后再分别进人NMR检测池进行扫描分析。在整个过程中，色谱峰并没有任何停顿，所以就解决了直接停留模式所带来的色谱峰展宽问题。生物色谱技术1生物色谱法（Biochromatography）是20世纪80年代中后期问世，由生命科学与色谱分离技术交叉形成的一种极具发展潜力的新兴色谱技术。适用条件：亲和色谱固定相和研究对象都是生物大分子细胞膜色谱固定相含有生物大分子常规色谱研究对象是生物大分子2细胞膜色谱Cell Membrane Chromatography, CMC将细胞膜结合到硅胶表面，制成细胞膜固定相，利用色谱学技术研究流动相中药物与受体相互作用规律的受体动力学新方法特点：分离 + 活性筛选 合二为一化学成分-效应-作用机理适合于天然药物活性成分的筛选及药物作用机理的研究。3亲和色谱Affinity Chromatography，AC利用生物大分子具有对某一类生物大分子特异性识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。亲和体系 ：特异性亲和体系高特异性抗原抗体荷尔蒙受体蛋白核酸互补碱基链段、核酸结合蛋白酶底物、产物、抑制剂群特异性免疫球蛋白A蛋白、G蛋白酶辅酶凝集素糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体酶、蛋白质肝素酶、蛋白质活性色素（染料）酶、蛋白质过渡金属离子（铜、锌等）酶、蛋白质氨基酸（组氨酸等）常见的亲和色谱名 称作用原理应 用免疫AF抗体和抗原专一性识别抗体或抗原固定化金属AF Cu2+、Zn2+、Ni2+等与蛋白质表面组氨酸的特异性识别含组氨酸的蛋白质染料AF染料和蛋白质的特异性识别激酶、脱氢酶核苷酸AF核苷酸和蛋白质的特异性识别激酶、脱氢酶凝聚素AF凝聚素和糖之间专一性的可逆的结合糖蛋白蛋白质A AF对IgG类似抗体的专一性免疫蛋白等亲和色谱分离原理1. 找与底物专一可逆结合的配体,将配体通过共价键偶联到载体。2. 配体与目标物吸附；3. 洗脱目标物4. 亲和柱再平衡。亲和色谱分离示意图亲和色谱的固定相1载体 （support，又称基体matrix无机氧化物：SiO2、Al2O3、ZrO3生物聚合物：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、葡聚糖等特性：亲水但不溶于水，可溶胀大孔且有一定的机械强度化学性质稳定且易于改性表面积很大但呈现惰性2. 配位体 （ligand，又称底物 substrate）专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度特异性配体生物素亲和素、抗原抗体、酶抑制剂、激素受体通用性配体凝集素各种糖蛋白，核酸RNA、RNA蛋白质3. 间隔臂 （spacer或spacer arms） 脂肪族有机物或多肽、蛋白组成； 具有双官能团，一端连接载体，一端偶联配体； 长度直接影响固定相的立体效应； 可在对载体进行化学改性的时候形成； 可具有疏水性或亲水性。影响亲和色谱的因素离子强度：提高离子强度，亲和作用减弱或完全破坏。 pH值：在适当的pH下，亲和结合作用较高，在其它pH下，亲和作用减弱或完全破坏。离液剂：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用。 温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是疏水性相互作用增强 液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失3.体积排阻色谱原理：是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法， 体积大的分子不能渗透到凝胶孔穴中去而被排阻，较早的淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。4.离子交换色谱原理：利用被分离组分与固定相之间发生离子交换能力的差异来实现分离。分子生物学技术名词解释:1分子生物学(Molecular Biology)：从分子水平研究生命现象的科学，是现代生命科学的“共同语言” 。通过生物的物质基础核酸、蛋白质、酶等生物大分子的结构、功能及其相互作用等运动规律的研究来阐明生命分子基础，从而探讨生命的奥秘。2重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。3限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。 4载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。DNA克隆，亦称分子克隆:获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的DNA片段，5表达克隆（expression cloning就是将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。6核酸分子杂交技术所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构7 DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质作用的一种特殊的凝胶电泳技术。8 DNase足迹实验是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。9 Southern DNA 印迹转移技术或称 DNA印迹杂交技术：根据毛细管作用，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段。 10诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）：将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。11韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）：将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应的技术。简答1 限制酶，在基因工程和基因诊断中的重要用途： 1) 不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。 2) 用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。 3) Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。2 载体具以下特征： 1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖； 2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点； 3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。 常用的载体有：质粒，噬菌体，粘粒，BAC，YAC等。3 DNA重组与分子克隆化基本过程1、分离纯化目的基因2、目的基因 + vector =重组DNA分子3、重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。4、筛选含有重组DNA的细胞细胞克隆（cell clone），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。5、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。 4重组DNA和分子克隆的几种方法：（依目的基因的来源）1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行 克隆3、化学合成目的基因进行克隆4、PCR体外扩增目的片段进行克隆5 Southern 印迹可用于分析基因拷贝数的变化基本过程：待测DNA样品的制备和基因探针的标记；待测DNA样品的电泳分离；电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的固相支持物；特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自显影或显色检测目的DNA的存在。 应用；研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。6 Northern 印迹可用于分析基因转录水平的变化：Northern blot是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析mRNA的常用方法原位杂交（in situ hybridization，ISH）即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术；应用：可用于基因及其表达产物的定位分析7 DNA迁移率变动实验、DNase足迹实验（footprinting assay）甲基化干扰实验(methyltion interference assay优缺点又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。 DNase足迹实验（footprinting assay）是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。 甲基化干扰实验(methyltion interference assay根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对之后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。DMS化学干扰的主要局限性是，它只能使G残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。8 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 是一种在体外特异地扩增已知基因的方法； 由K. Mullis于1983年建立； 可用于分析基因及其产物的水平变化； 可进行实时、定量分析； 可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列的相互作用。 9 DNA序列分析1、通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组的变异2、通过DNA序列测定分析人工重组的基因3、 通过DNA序列测定对定点突变进行确认10 什么是DNA芯片（DNA chip）1在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针，与待测荧光标记样品进行杂交；2通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达)； 3亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。 11利用DNA芯片技术1芯片每个探针是cDNA片段或基因的一段PCR产物，可以同任何具有同源序列的样品形成杂交体，同时定量监测大量基因的表达。2寡核苷酸芯片利用基因特异的寡核苷酸片段为探针，每个基因有1020个相对应的探针，对低丰度基因表达水平变化的检测具有高度灵敏性。 11 染色质免疫共沉淀与芯片技术结合检测蛋白质-DNA相互作用 ChIP-on-chip（chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip）的基本原理： 染色质免疫共沉淀与芯片技术相结合 它的基本原理是在活细胞状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联，超声波将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后用所研究的目的蛋白质特异性抗体免疫沉淀蛋白质-DNA复合体，从而特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。12 ChIP-on-chip应用 目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选。 13 ChIP-on-chip适于DNA-核蛋白相互作用及表观遗传学研究： 主要集中在两个领域： 第一，确定转录因子及其作用位点：能够将直接与蛋白结合的基因作为靶点，数据可以直接用于生物信息学分析，更直接地识别转录因子结合元件。 第二，确定基因表观遗传修饰，应用于表观遗传学研究。 表观遗传学的主要研究内容包括甲基化，组蛋白修饰和染色质重塑等。 ChIP-on-chip技术可提供基因编码区中组蛋白甲基化分布模式的信息：CpG岛表达序列标签芯片，可以显示基因组内CpG甲基化和组蛋白修饰之间的联系。14 酵母双杂交技术(一）酵母双杂交系统利用报告基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用（二）酵母双杂交可通过蛋白质相互作用鉴定/分离新的相互作用蛋白及其编码基因（三）哺乳动物双杂交系统是在酵母双杂交系统基础上发展的电泳技术一名词解释1. 电泳：带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。2. 迁移率：是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度3. 电场强度：也称电位梯度，是指单位长度(每1cm)支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用。 4. 凝胶原理5. SDS作用与变性、非变性6. 连续系统：缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。7. 不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。8. 等电点：在某一PH下，蛋白质分子在电场中不再移动，即静电荷为零，则此PH值即为该蛋白质的等电点。9. SDS: 是一种阴离子去污剂，它在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在。这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合从而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。10. Cell Membrane Chromatography, CMC：以含受体的细胞膜为固定相，利用溶质分子与相应受体大分子间特异性分子间作用力的不同进行分离测定的液相色谱方法。二简答1.电荷的来源胶体颗粒表面的电荷来源是：吸附液体中的某离子，因而带电，液体失去该离子而带相反的电荷。作为胶体组成成分的相反符号的离子不等量的进入溶液而带电。固体表面吸附液体分子，然后这些分子解离，因而带电。 2.影响电泳迁移率的因素可以分为以下三大类：(a)与泳动离子(或粒子)本身的特性有关的因子，如电荷符号和大小、本身的大小和形状、水化程度、解离趋势、两性性质等。(b)环境因素，如缓冲液浓度、离子强度、介电性质、化学性质、pH、温度、粘度、有无极性分子存在(因为它可以影响粘度或介电性)等。在有支持物的情况下，影响因素更多，如支持物的吸附作用，不均一性、离子交换能力、电渗现象、虹吸作用、热和蒸发作用等。(c)所加电场的特性，如强度和纯度(是否杂有交流电)。这些因素在实验过程中要充分注意，尽量保持条件恒定不变，以便获得可重复的结果。3.电泳的分类（一）按分离的原理区分电泳按分离的原理可分为4种，即:a.区带电泳(zone EP，ZEP)：不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，如果用光密度计扫描可得出个个互相分离的峰。b.移界电泳(moving boundary EP，MBEP)：它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得出一个个台阶状的图形c.等速电泳(isotachophoresis，ITP)：在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按浓度对距离作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。d.等电聚焦(isoelectric cusing，IEF): 由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成pH梯度。被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率很高。（二）按有无固体支持物区分根据电泳是在溶液中进行还是在固体支持物上进行，又可以分为自由电泳和支持物电泳两大类。自由电泳又可分为：显微镜电泳(也称细胞电泳) ；移界电泳；柱电泳；自由流动幕电泳；等速电泳； 4.电泳技术的特点凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可进行定性或定量分析；样品用量极少；设备简单；可在常温进行；操作简便省时；分辨率高。5.常用的电泳技术一、Tiselius移界电泳法Tiselius的移界电泳法具有重要的历史意义，它的成功在于巧妙地解决了几个问题：能够形成清晰的起始界面；靠密度梯度能够稳定界面；能良好的散热；在泳动过程中可用光学方法显示其组分。二、区带电泳1）、滤纸及醋酸纤维素薄膜电泳它具有简单快速等优点：电泳区带界限清晰；通电时间较短(20min至1 h)；对各种蛋白质基本无吸附，因此无拖尾现象；不吸附染料，显示电泳区带背景干净。操作简单、快速、廉价。已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋 白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中2）、高压电泳 高压电泳适用于分离低分子物质，如氨基酸、肽、抗生素及其他有机和无机物。因为低分子物质易扩散，高电压可使其移动快，在短时间内达到分离，减少扩散的影响。3）、连续电泳用一张垂直悬挂的滤纸作支持物，由上方连续加样，缓冲液连续由上方流下来，电极加在左右两方，电场方向与液流方向垂直。分离的成分由下方分别以试管收集 4）、凝胶电泳（1）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是由D半乳糖和3、6脱水L半乳糖结合的链状多糖 影响琼脂糖凝胶DNA迁移速率的因素：迁移速率由DNA的分子大小、琼脂糖浓度、DNA的构象、所加电压、电场方向、碱基组成与温度、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等许多参数确定。实验步骤：制胶，加缓冲液，拔梳子，点样，电泳，紫外（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)早在1959年由Raymends和 WeintraubL建立。1964年，此法进一步从理论和实验技术上得到改进并推广应用。由于具有较高的分辨率和灵活性，目前已被广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离和分析。 实验步骤：安装玻璃板，灌注分离胶，灌注浓缩胶，根据需要插入不同的梳子，30min左右加电泳缓冲液，再拔梳子，点样，电泳染 色： 蛋白质电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法有考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法硝酸银染色银染的机制:来源于摄影银染技术,是将蛋白分子结合的银离子还原作成金属银。优点:检测灵敏度高,较普通考马斯亮蓝染色灵敏度要高50-100倍,可在蛋白质中找到含量较低的蛋白,而且所需的上样量较少(每点仅需0.1)。缺点:可重复性差 耗费人力 质谱测定有一定的干扰硝酸银染色染色方法：化学显色（双胺染色）：是利用氨水同硝酸银进行反应产生银-双胺络合物,将固定后的凝胶浸泡其中,再通过酸化使其显色。（非双胺染色）：是将固定好的凝胶浸泡于酸性的硝酸银中,在硝酸银和蛋白质发生作用后在碱性条件下,用甲醛还原使其显色。光显色：是使用光能还原银离子成金属银。因为光能够在酸性PH还原银,所以一旦凝胶被固定,光显色能使用单一染色溶液,而不像化学染色程序那样通常需要两种溶液。6.聚丙烯酰胺凝胶的主要优点：分辨率高。具有三种效应：浓缩效应，分子筛效应，电荷效应；长度仅仅相差0.2(即500bp中的1bp)的DNA分子即可分开；（例）所能装载的DNA量远远大于琼脂糖凝胶；从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高。可根据被分离物质的分子大小控制凝胶浓度制成不同孔径的凝胶。丙烯酰胺较稳定，无色透明，机械强度好，易观察，可用检测仪直接测定。 7.等电聚焦： 优点：分辨率很高；样品可混入胶中或加在任何位置，在电场中随着电泳的进行区带越来越窄，克服了一般电泳的扩散作用。电泳结束后，可直接测定蛋白质pI。 分离速度快，蛋白质可保持原有生物活性缺点： 电泳中应使用无盐样品溶液，否则高压中电流太大而发热。但无盐时有些蛋白质溶解性能差易发生沉淀，可在样品中多加些两性电解质。许多蛋白质在pI附近易沉淀而影响分离效果，可加些脲或非离子去垢剂解决。8.双向电泳第一向根据蛋白质的等电点不同在PH梯度胶中等点聚焦。第二向根据蛋白质的分子量大小不同在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)9.蛋白质印迹 蛋白质印迹方法将高分辨率的电泳技术与灵敏的、专一的免疫探测技术结合起来,用针对蛋白特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针进行检测.对于蛋白质,通常使用的探针是抗体,它与附着于固定基质上的靶蛋白发生特异性反应.10、免疫电泳：a、抗原抗体特异性反应。b、抗原在pH8.6时通常带强负电，而抗体不带电。c、抗原在含有抗体的凝胶中电泳时发生免疫反应，抗原过量，仅产生可溶性的免疫复合物与抗原一起向阳极移动。d、抗原与抗体浓度达到当量点时，形成免疫沉淀带免疫电泳(immunoelectrophoresis，IEP)是将区带电泳与双向免疫扩散相结合的一种免疫化学分析技术。先将蛋白质抗原在琼脂平板上进行电泳，使不同的抗原成分因所带电荷、分子量及构型不同，电泳迁移率各异而彼此分离。然后在与电泳方向平行的琼脂槽内加入相应抗体进行双向免疫分散。分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的弧形沉淀线。根据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的标准(或正常)抗原抗体形成的沉淀线比较，即可对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。 对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis, CIEP) 双向免疫扩散与电泳相结合的技术。在pH8.6的缓冲液中，抗原向正极泳动；而抗体大部分属于Ig，由于分子量大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动 (电渗使液体向负极泳动) 在抗原抗体相遇的最适比例处形成乳白色沉淀线。由于电场的作用，限制了抗原、