C18反相硅胶柱的使用.doc

各位战友：我现做皂苷类化合物的分离，需要用到C18反相硅胶柱，不知大家有没有这方面的经验，一起探讨我现有几个问题向大家求教！1. 使用HPLC C18 柱摸出来的条件，走C18反相硅胶常压柱，发现HPLC在某一浓度梯度洗脱下来的东西，恰恰在同一梯度条件下，用反相硅胶常压柱却洗脱不下来，存在很严重的滞后现象，这样一来用HPLC C18 柱摸出来的条件走反相硅胶常压柱根本起不到多大的分离作用不知大家在走反相常压柱时，其洗脱梯度是如何摸的？怎样解决HPLC和一般常压柱之间滞后问题？2. 在走反相硅胶常压柱时，如何判断某一浓度梯度样品是否完全洗脱完呢？有没有既方便快捷，又有效的方法？可否用正相TLC板来检测呢？3. 在使用反相硅胶常压柱分离皂苷类化合物时，怎样才能使柱子的柱效比较高，不知大家有没有一些小技巧？老光头2007-03-28 18:20不好意思，还忘了问一个问题：上样量和反相硅胶的比例为多少时，分离效果较好？老光头2007-03-28 18:201. 使用HPLC C18 柱摸出来的条件，走C18反相硅胶常压柱，发现HPLC在某一浓度梯度洗脱下来的东西，恰恰在同一梯度条件下，用反相硅胶常压柱却洗脱不下来，存在很严重的滞后现象，这样一来用HPLC C18 柱摸出来的条件走反相硅胶常压柱根本起不到多大的分离作用不知大家在走反相常压柱时，其洗脱梯度是如何摸的？怎样解决HPLC和一般常压柱之间滞后问题？我们一般用反相C18层析板来摸条件的，。用液相来摸条件太慢了。而且有一定的差别。可以找绿百草买。2. 在走反相硅胶常压柱时，如何判断某一浓度梯度样品是否完全洗脱完呢？有没有既方便快捷，又有效的方法？可否用正相TLC板来检测呢？呵呵。只能点板拉。没别的办法，又不能单纯看颜色的判断。可以用正相板来检测的。但如果你的东西是正相一个点，反相几个点的时候一定要小心注意拉。别判断错了。3. 在使用反相硅胶常压柱分离皂苷类化合物时，怎样才能使柱子的柱效比较高，不知大家有没有一些小技巧？ 柱效高是你装柱的问题，要尽量装紧点，用甲醇冲一段时间，让它压紧。你的是常压柱？那可能会很慢的阿。干嘛不买个蠕动泵加点压阿？4.上样量和反相硅胶的比例为多少时，分离效果较好？一般上样量200-300mg，柱长约50-60cm。不过我认为这看你的样品斑点的多少来确定把。如果斑点较少，上样可稍多点。总之，鄙人认为反相柱的确是个好东西。我的咚咚基本都用过它来分。用反相柱最重要的是一定要有耐心，绝对急不来的。极性不能加得太大（约是你摸好条件的1/2之比例），不然就功亏一篑了。祝你好运！老光头2007-03-28 18:20谢谢windy81的建议!反相板太贵了,我们可能用不起哟.不过我还是想问一下,你的用反相板摸条件具体是怎么做的?因为我们从来没有用反相板摸过条件,诚恳不吝赐教!老光头2007-03-28 18:201、HPLC的柱效在10万以上，不过用的填料粒径在5um，而常用的反相常压柱，粒径4060um，柱效只有1000，并且速度要慢很多，这就造成楼主说的滞后。解决办法只能靠走反相板，或者根据经验来。Merck的反相板是比较贵，不过你可以每次用甲醇反复展开清洗几次，然后拿来重新用啊。摸条件和走正相板子一样，多尝试一下。2、判断是否走完，点板就可以了。3、装柱最好加压，能加多大压力加多大压力，我们装柱用的是耐压的玻璃柱，装柱压力可以达到7bar，柱效比常压沉降的好很多。4、上样量跟你的柱体积，柱床高度很有关系。如果能加压，反相柱床高度40cm就足够了，上样量根据柱内径来算，原则是摸条件时不超过柱体积的1，如果分离度很好，可以过载加大上样量。其实皂苷类的化合物用Sephadex LH20分效果也不错，能够使用的溶剂很宽，不同的溶剂洗脱行为差异很大，而且算下来使用成本比反相硅胶还是要少的，毕竟Sephadex LH20耐酸碱，在甲醇中能溶胀4倍。老光头2007-03-28 18:20谢谢handson的建议！其实我们的样品用Sephadex LH20分离了五六次，效果都不怎么样也不知道是什么原因，但我们发现用Sephadex LH20分离时，可以除掉其中大量的色素，就是不能将主要样品分开麻烦handson给我指点迷津，本人不胜感激！老光头2007-03-28 18:20走反相板好一点儿.老光头2007-03-28 18:20请问各位：我的样品在紫