绿色荧光蛋白在转基因动物中的应用.docx

绿色荧光蛋白在转基因动物中的应用 杨军廷 201141804054 华大基因 摘 要 来源于水母 (AequoreaVictoria)的绿色荧光蛋白 (Greenfluorescentprotein ,GFP) ,现已成为细胞生物学和分子生物学中应用最广泛的分子标记之一。其内源性荧光基团在受到紫外或蓝光激发时可发现清晰可见的绿光。由于检测方便 ,对生物体基本没有毒性 ,在很多领域已有取代LacZ ,荧光素酶等传统标记方法的趋势 ,在制作转基因动物过程中更是如此。本文综述了GFP在标记目的基因、筛选阳性胚胎等方面的应用 关键词 绿色荧光蛋白；转基因 在研究基因的表达或蛋白质的定位与时序变化时常用荧光物质或报告基因作为标记。传统的荧光标记是通过纯化蛋白质再共价结合到荧光染料上!此方法难以控制化学剂量和染料附着部位!若该标记蛋白用于活细胞内检测!则难以通过细胞膜。因此，该方法已基本淘汰现在常用的报告基因如荧光素酶（LUX）基因和-葡萄糖苷酶（GUS）基因也不尽人意。LUX所检测到的荧光产生部位不一定反映荧光素酶基因的特异表达部位；GUS则需要昂贵的反应底物且由于其它因素的干扰。反应颜色的深浅有时不能说明GUS活性的高低或有无.源于水母等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP)可吸收蓝光而后发出绿光是生物发光现象中能量传递的受体之一。它克服了上述缺陷，具有灵敏度高、操作简便，不需要添加任何底物或辅助因子，不使用同位素，也不需要测定酶的活性等优点。已成为目前最优良的标记基因之一。1 GFP的生化性质及其发光原理1.1 GFP的发光特性GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察。尽管450490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰,但由于长波能量低,细胞忍受能力强,因此更适合于活体检测.1.2 GFP的性质特点 GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强,特别在450490nm蓝光波长下更稳定。GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等。GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。1.3 GFP的发光原理 GFP之所以能产生绿色荧光是由于其蛋白分子多肽链内含有特殊的生色基团结构。即第65-67位氨基酸Ser-Tyr-Gly链内环化加氧形成对羟苯甲基咪唑环酮和周围其它3个氨基酸形成六肽生色团。但上述3个氨基酸残基是如何控制光谱的特征目前还不十分清楚。体外试验时，当Ca2与来自水母的发光蛋白质结合时，便可以观察到一种蓝光。这种分子内的反应受一种在结合了Ca2后转化为荧光素酶蛋白质的催化，产生CO2和蓝色荧光蛋白（BFP）在反应中也是一种发光体!如果在反应体系中加入GFP即可以观察到绿光!这一体外模拟试验与水母自然的发光现象一致。总的过程可用下式表示1.4 GFP作为标记的优点14.1体积小 只有LacZ的1/5，表达无种属限制，这是它能广泛应用的重要基础之一。一系列与GFP的N-端、C-端融合的蛋白质的性质研究已证明：融合蛋白质同时具有GFP的荧光特性和结合蛋白质的功能。1.4.2 荧光表达稳定 即使是在甲醛或戊二醛固定的标本中，GFP的荧光仍能保持稳定但固定过程中使用了酸或过量的有机溶剂，则会破坏荧光。在各种制备切片的方法中，冰冻切片是效果最好的。标本可在70保存6周以上而荧光不受影响1.4.3有多种突变体 不仅可与其它标记物，也可用不同突变体同时进行多种标记。1.4.4检测方便 常用荧光显微镜，激光扫描共聚焦显微镜（Iascer-scanning confocal microscope，ISCM）观测。若在体表等容易观测的部位且荧光够强，则可直接用长波长紫外灯照射（如手提式长波长紫外灯）后观察。可观测荧光的仪器越来越多。1.4.5无放大作用 因而，很多情况下需要强启动子。这使536在研究一些弱启动子功能时受到限制。随着检测手段的不断改进，这一限制已被逐渐缩小。正是由于以上这些特性，使536在问世后不久，便被广大科研工作者广泛应用。2 在转基因动物中的应用2.1 基因打靶和胚胎干细胞技术基因打靶和胚胎干细胞技术的出现为小鼠基因组操作引进了新的方法。胚胎干细胞是来源于后胚泡期胚胎的多能干细胞系，经体外繁殖和处理后可再导入胚胎。自人们从胚胎干细胞克隆出小鼠生殖细胞，并证明将亲本的基因组传递给后代后，胚胎干细胞就成为常用的工具。现在，只要在体外进行基因打靶和转基因操作，就可通过生殖细胞将亲本的基因组传递给后代。在胚胎干细胞中可进行两种基因组改造：定向改造和非定向改造。定向改造就是预先确定并精确设计所要做的改变，基因打靶就是定向改造。非定向改造是随机的，包括转基因和突变。研究中，这两种方式可混合使用以达到不同的目的。同源重组和点特异重组可对基因组进行任何想要的改变。可通过多种方式进行随机突变，利用外源基因陷阱载体可在基因组中随机定位，从而“劫持”基因表达并破坏基因功能。胚胎干细胞的另一种应用是转基因，它与经典的原核注射类似。在体外，将载体自身的驱动目的基因（通常为报告基因）的启动子整合入基因组，然后导入体内。因此，任何改造都能够导入胚胎干细胞，随后通过生殖细胞传递给后代，这样就可以建立小鼠突变品系或嵌合体，从而进行原位研究了。由于转基因细胞系能在体外增殖，所以与DNA注射相比，用ES细胞制备转基因动物的优势在于，可在动物模型体外使用试剂进行研究。2.2标记基因直接检测外源基因在动物体内的表达和分布常常是困难的。因此，在制作转基因动物时，一般在目的基因旁边加上一段表达产物易于检测的基因，即标记基因。标记基因的表达与分布提示目的基因的表达与分布。LacZ，Iuc等都是广泛使用的标记基因，其产物能催化一定的底物生成有色产物或荧光。由于GFP发光时不需底物，能对活体检测等优点，越来越多的人倾向于用它代替传统的分子标记物。GFP与蛋白融合时，既可融合于蛋白的N-端，也可融合与蛋白的C-端，甚至能让蛋白插入到编码区之间而保持荧光特性不变由于GFP体积较小，只有27KD，融合后常能保持蛋白的正常分布与功能。不同的是现在能发光了。发光的蛋白能给研究者有关基因时间、空间表达的有用信息。这方面成功的例子很多，被成功标记的蛋白目前已超过100种.Morilz OL将视紫红质蛋白（rhodopsin，RHO）基因与GFP的cDNA融合制作转基因爪蟾。作者根据荧光观察了RHO表达随时间变化的规律，并将转基因动物表达的RHO-GFP与天然RHO作了对比：RHO-GFP能正确地定位，虽然被磷酸化的速度减慢，但对其行使光传导功能影响很小。磷酸化速度减慢的原因是GFP的占位。因为27KD虽然不大，但仍会影响某些蛋白的折叠。寻找分子量更小的GFP突变体，是今后GFP研究的一个重要目标。GFP也可直接接在启动子后，观测该启动子的表达、分布情况或特异性标记某种细胞、组织或器官。这是GFP在转基因动物研究中应用最早、最多的一个方面。Chiocchclli等在血红素结合蛋白（hcmopcxin，HPX）启动子和1结合素启动子之后加上GFP或LacZ报告基因（共4个质粒），制作转基因小鼠。其中，HPX启动子能指导下游基因在肝脏强表达和部分脑区弱表达，而1结合素启动子能指导下游基因在胚胎发育过程中全身表达。作者比较了这9个报告基因的表达情况。实验中发现：用GFP作报告基因，不仅检测方便，而且不论是强表达还是弱表达，全身表达还是区域表达，都与启动子指导的天然蛋白的原位杂交结果更加一致。2.3筛选阳性胚胎制作转基因动物的一个很大的问题便是阳性率低。从大量的动物中筛选出转基因阳性动物，是一个耗时耗力的过程。若在胚胎移入假孕母体以前就能用可靠的方法筛选出转基因阳性胚胎，弃去基因未整合或表达不好的胚胎，将大大降低出生后动物个体筛选的工作量，并降低成本。在桑葚胚或胚泡阶段用活组织检查结合PCR或RT-PCR的方法需要复杂的显微操作技术，并可能损伤胚胎，耗时较长，并可能有假阳性或假阴性。Thompsom等用荧光素酶作标记基因，在移植前检测。这种方法需要在培养基中加入一些辅助因子，检测过程较复杂；Takada等将EDFP的cDNA置于EF1启动子和CMV增强子之下，注入小鼠和牛的受精卵内，在体外培育至桑葚胚阶段或胚泡阶段。此时，GFP表达，用CLSM可检测出荧光。用能表达荧光的胚胎作移植，出生后的小鼠发育正常，能表达外源基因（GFP）。牛的胚胎移植后未能成活。这种方法对胚胎没有损伤，检测方便。虽然此次实验只注射了标记基因，但从实验过程来看，加入外源基因是没有技术困难的。此实验还证明了每天用,405mm的紫外照射胚胎，并不影响植入和发育。GFP不仅可与外源基因构成双顺反子，也可单独与外源基因共注射。以摩尔比1:1共注射后，80%的转基因鼠同时携有两种基因，20%的转基因小鼠只携有其中一种基因。对于大动物来讲，由于受精卵来源有限，实验周期长，费用高等限制，用此法有更大的优越性。不仅在制作转基因动物时，而且用于F0代之后扩大转基因群体。因为对大动物来讲，传代也是一个耗时的过程。但如果能将雄性found动物的生殖细胞取出，于雌性野生动物的卵子在体外受精并培养，并在植入前用GFP筛选，也将大大缩短扩大转基因动物群体的时间。在某些全身透明的鱼类，用能在生殖细胞特异表达的启动子与GFP融合后，可方便地根据荧光标记筛选出有生殖系整合的转基因动物3 问题和展望从1994年Chalfie等首次在果蝇、大肠杆菌等生物体内成功表达GFP基因到现在已有十几年的历史，越来越多的研究人员将其作为又一快速高效的研究工具。虽然GFP在分子生物学的众多研究领域有着广泛的应用，GFP本身也将不断地被改进及优化，GFP的应用在技术上将出现更多的创新，其应用范围将会越来越开阔。但在研究中仍然存在着一系列的问题，包括：检测灵敏度还有待提高，而且其荧光信号强度方面的非线性性质使得定量非常困难也有待于进一步研究。新生GFP通过折叠和加工成为具有活性的形式其过程十分缓慢。紫外激发对某些GFP有光漂白和光破坏作用，会导致荧光信号快速丧失。多数生物具有微弱的自发荧光现象，并有着类似的激发和发射波长，这些荧光背景会影响某些GFP的检测。目前为止大约有几十种不同特性的荧光蛋白可供选择使用，这些蛋白质的荧光光谱几乎覆盖了整个可见区9。一个好的荧光蛋白需具备以下几个特点：抗酸、抗漂白、亮度高、成熟快及单体结构。随着对GFP的基础理论研究的深入，新一代GFP衍生物荧光信号和蛋白的可溶性等的明显提高，成像技术和显微镜的改进，新型计算机及应用程序的出现，相信这些问题终将得到解决。与此同时，随着基因工程技术和细胞工程技术的日益成熟，GFP一定会带来更多的应用价值，并进一步揭开生命的未解之谜。但是，基于细菌间