蛋白质电泳2.doc

蛋白质电泳一、 蛋白质电泳的原理 蛋白质是由一条或几条多肽链按各自特殊的组合方式形成具有完整生物活性的分子。蛋白质是两性电解质，当处于等电点pI时，蛋白质分子本身静电荷为零，通常在偏酸性的溶液中带正电，在偏碱性的溶液中带负电。温度，pH，化学因子等因素易引起蛋白质变性。通常使用电泳的方法对其进行分离纯化。因蛋白质是两性电解质，在一定pH条件下，蛋白质带有电荷，不同的蛋白质所带电荷种类和数量不同，因此在电场中移动的速度不同，从而把蛋白质分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：有两种，添加SDS （十二烷基磺酸钠）的变性SDS-PAGE和不添加SDS的非变性PAGE。它是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵(AP)作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶，有分子筛作用。凝胶孔径随BisAcr比例的增加而变小。比例为1:20达到最小，一般实验按1:29配制，能分开相差约3%的蛋白质。SDS-PAGE：蛋白质与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。由于十二烷基硫酸根带负电荷，使SDS-蛋白质复合物都带上负电荷，而且大大超过蛋白质原有的电荷量，所以掩盖了蛋白质原有的电荷量的差别，因此，蛋白质电泳的迁移率取决于蛋白质分子量的大小。此外，SDS使蛋白质构象改变为长椭圆棒，长度与分子量大小正相关，所以也可以用这种方法测蛋白质的分子量。凝胶系统：根据缓冲液的pH值和凝胶孔径差异，分为连续凝胶系统和不连续凝胶系统。连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均比前者好，目前使用最广泛。二、操作步骤1.SDS-PAGE试验试剂（1）丙烯酰胺（Acrylamide.简写Acr）（2）甲叉双丙烯酰胺（N,N-methyleneBisacrylamide.简写Bis）（3）四甲基乙二胺（N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine.简写TEMED）（4）过硫酸铵（简称AP）（5）三羟甲基氨基甲烷（简写Tris）（6）氨基乙酸（7）溴酚蓝（8）考马斯亮蓝（9）巯基乙醇（10）冰醋酸（11）乙醇（12）甘油（13）盐酸（14）十二烷基硫酸钠（SDS）（15）甘氨酸（Gly）（16）十二烷基硫酸钠（SDS）（17）琼脂糖 2.试剂配置（1）1.5mol/LTris-HClpH值8.8：量取3mol/LTris母液50mL，用盐酸调节pH至8.8，用重蒸水定容至100mL(4存放)。（2）0.5mol/LTris-HClpH值6.8：量取1mol/LTris溶液50mL，用盐酸调节pH至6.8，用重蒸水定容至100mL(4存放)。（3）10%SDS（室温存放）。（4）30%Acr/Bis：29.2gAcr、0.8gBis，用重蒸水定容至100mL，过滤备用(4存放)。（购买30%Acrylamide）（5）10%过硫酸铵（Aps）：临时配制。0.1gAP+1ml 水（6）TEMED。（7）2倍上样缓冲液：含有0.5mol/LTris-HCl（pH6.8）2mL、甘油2mL、20%（W/V）SDS2mL、0.1%溴芬蓝0.5mL、2-巯基乙醇1.0mL、重蒸水2.5mL（室温存放备用）。（8）5倍电泳缓冲液：含有Tris7.5g、甘氨酸36g、SDS2.5g，用重蒸水溶解，定容至500L，使用时稀释5倍使用(4存放)。（9）染色液：0.2g考马斯亮蓝R-250、84mL95%乙醇、20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用。（10）脱色液：医用酒精：冰醋酸：水=4.5：0.5：5（V/V/V）。（11）保存液：7%冰醋酸。（12）封底胶：1%琼脂糖（用蒸馏水配制）。(13)Lowing Buffer:组分浓度：250mM Tris-HCL(pH6.8)、10%(W/V)SDS、0.5%（W/V）BPB、50%（V/V）甘油、5%（V/V）-巯基乙醇（2-ME）配制方法，以5ml为例：量取1.25ml的1M Tris-HCL(pH6.8)、0.5g SDS、25mg BPB、2.5ml 甘油于10ml塑料离心管中。加去离子水溶解后定容至5ml,可以将小分（约500l）分装后，于室温保存，使用前将25l 的2-ME加到每小份中，加入2-ME的Lowding Buffer可在室温下保存一个月左右。也可以不分装按比例加入2-ME于4冰箱保存。（14）蛋白质样品处理：m克上样量一般是多少？蛋白样品/蛋白样品浓度=需上样蛋白质样品体积（蛋白质上样量一般为50ng、75ng、100ng、150ng、300ng不等，视蛋白质具体浓度确定，一般上样体积不超过20l） 需上样蛋白质样品体积：5 lowding Buffer=4:1将混合液于PCR仪中，设定程序100 5 min 。（出错步骤，未加Lowding Buffer变性，变形之后加的Lowding Buffer）(按照（13）中lowding buffer的配制，其中含有SDS，故不需要再次加入)3.实验步骤（1）清洗玻璃板：用洗洁精将玻璃板正反两面及100ml烧杯清洗干净，并用双蒸水冲洗，可置于烘箱中晾干。（2）灌胶与上样、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。） 、按附图配方配10分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用1000l枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带下部线高度时即可。然后胶上加一层水（或乙醇），液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。） 、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 、按前面方法配5的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 、用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）将电泳缓冲液加入到两板之间至溢出，并查看是否漏液。 、上样将按照上文中处理好的蛋白质样品加入上样孔中。（蛋白质样品处理：m克蛋白样品/蛋白样品浓度=需上样蛋白质样品体积，需上样蛋白质样品体积：5 lowding Buffer=4:1，将混合液于PCR仪中，设定程序100 5 min）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。在中间的上样孔中加入蛋白质Maker和Lowding Buffer的混合样，作为分子标尺。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染，上样总体积一般不超过15l，加样孔的最大限度可加20l样品。）（3）电泳 电泳时间一般23 h，在跑浓缩胶跑一般根据8V/cm设定,一般为80V，当样品跑出浓缩胶进入分离胶时提高电压，一般设置电压可根据15V/cm设定，一般为120V ，当样品将要跑出胶尚未跑出时停止电泳。（4）染色使用上文配置好的染色液进行染色（加入量以刚没过胶即可）4小时以上，可过夜染色。（5）脱色使用上文配置好的脱色液进行脱色，加入量一般为没过胶即可，每隔12小时换脱色液，一般12次，注意脱色程度，不要脱过。（6）观察附录：1、SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)配方各组分名称各种凝胶体积所对应的各种组分的取样量1ml2ml3ml4ml5ml6ml8ml10mlH2O0.681.42.12.73.44.15.56.830%Acrylamide0.170.330.50.670.831.01.31.71.0M Tris-HCl(pH6.8)0.130.250.380.50.630.751.01.2510% SDS0.010.020.030.040.050.060.080.110%过硫酸铵0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.012、SDS-PAGE分离胶配方6%Gel各种凝胶体积所对应的各组分的取样量各组分名称5ml10ml15ml20ml25ml30ml40ml50mlH2O2.65.37.910.613.215.921.226.530%Acrylamide1.02.03.04.05.06.08.010.01.5M Tris-HCl(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.510% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.0240.0320.048%GelH2O2.34.66.99.311.513.918.523.230%Acrylamide1.32.74.05.36.78.010.713.31.5M Tris-HCl(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.510% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.0240.0310%GelH2O1.94.05.97.99.911.915.919.830%Acrylamide1.73.35.06.78.310.013.316.71.5M Tris-HCl(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.510% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.0212%GelH2O1.63.34.96.68.29.913.216.530%Acrylamide2.04.06.08.010.012.016.020.01.5M Tris-HCl(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.510% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.012