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不同果蔬中过氧化物同工酶分离及活力测定叶盛珺3100100231 胡梦琦 陈凯利目的：1、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 2、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程 3、学习过氧化物酶同工酶电泳过程及活性测定方法原理：过氧化物同工酶同工酶是指其催化的化学反应相同，而酶的结构、理化性质乃至免疫性质不同的一组酶。植物在发育过程中，所含同工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，因此作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有重要的意义。 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，测定这种酶的活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带。过氧化物酶能催化过氧化氢使联苯胺氧化成蓝色或棕色产物，据此即可将该酶在凝胶中显色定位。以大豆、绿豆为材料，低速离心去除细胞碎片，得过氧化物酶同工酶粗品。以愈创木酚为过氧化物酶的底物，在过氧化物酶的催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大吸收值，故可通过测定470nm处的吸光值的变化可以测定过氧化物酶的活性。 电泳分离测定过氧化物酶粗提取 分光光度计活性测定方法一 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离测定一、原理：1、聚丙烯酰胺凝胶的形成、结构及特性 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）和N，N- 甲叉双丙烯酰胺（Bis）聚合而成的大分子。凝结过程：过硫酸铵溶于水产生大量自由基，引发Acr与Bis也形成自由基，在四甲基乙二胺（TEMED）催化下这些自由基之间进行反应而聚合成凝胶。聚丙烯酰胺凝胶是具有立体（三维）网状结构的大分子。 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 凝胶电泳具有一般电泳的电场效应，即在一定pH的溶液中，样品分子由于解离或吸附，使自身带一定的电量，在相同的电场强度作用下，不同的样品分子因带不同的电性和电量，电泳时具有不同的泳动速度，使最终的迁移距离不同而分离。凝胶电泳与其他电泳的重要区别是它除了有电场效应外，还具分子筛效应：凝胶是一种立体网状结构物质，样品分子在通过凝胶网孔时受到摩擦力等的作用，其结果：体积小、且为圆球状的样品分子受到的阻力较小，移动较快，而体积大，形状不规则的样品分子受到的阻力较大，移动较慢。因此，凝胶电泳不但从分子带电情况的差别，而且还从分子大小、形状等方面的差别来分离样品分子，具有很高的分辨力。聚丙烯酰胺凝胶常分为两大类，一类是连续的凝胶，另一类为不连续的凝胶。前者凝胶系统的pH值、凝胶孔径是均一的，电泳过程中缓冲系统的离子强度及溶胶体系的各部分电位梯度都是一致的。而后者则刚好相反；前者电泳时只有电场和分子筛两种物理效应，而后者除此外还有样品的浓缩效应，故具更好的分离效果。样品分子在上层大孔径的浓缩胶中快速移动到小孔径的下层分离胶时，由于凝胶孔径突然变小而移动速度大大减慢，使之在浓缩胶与分离胶的界面处被浓缩成一狭窄的区带，一齐进入分离胶，然后再进行与连续凝胶电泳类似的电泳分离。3、过氧化物酶同工酶凝胶电泳 过氧化物酶是植物体内的常见氧化酶。植物体内许多生理代谢过程常与其活性及其同工酶的种类有关。利用特异性颜色反应使待测酶着色，便可在凝胶中展现出酶谱。 利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于含有H2O2及联苯胺的溶液中染色，出现蓝色或棕褐色部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化物酶同工酶酶谱。二、实验材料A分离胶缓冲液/100mL1mol/L HCL 48mL Tris 36g TEMED 24L pH 8.9B浓缩胶缓冲液/100mL1mol/L HCL 48mL Tris 5.9g TEMED 48L pH 6.7C分离胶贮液/100mL丙烯酰胺 30g 亚甲基双丙烯酰胺 0.8gpH 8.9D（浓缩胶贮液）/100mL丙烯酰胺 10g 亚甲基双丙烯酰胺 2.5gpH 6.7E 核黄素/100mL核黄素 4mgF 蔗糖/100mL蔗糖 40gG 电极缓冲液/100mL （用时稀释10倍）Tris 6g甘氨酸 28.8gpH 8.3H 封板胶（加热煮沸）琼脂粉 1g电极液 100mLI 样品提取液0.1mol/L磷酸盐缓冲液 pH7.6临用时，每100mL提取液中加：蔗糖 25.32g甘油 16.7mL溴酚蓝 0 .1gJ 染色液2%联苯胺 10mL抗坏血酸 35.2mg0.6%H2O2 10mL水 30mLK 前沿指示剂0.1%溴酚蓝L 各种果蔬白菜、萝卜、梨若干三、实验设备1、稳流稳压电泳仪；2、冷冻离心机及离心管； 3、成套电泳槽；4、微量进样器（50L）5、高速离心机（10 000r/min）6、量筒：500mL，10mL，5mL（各1）7、烧杯：250mL48、pH试纸；9、其它常规用具（玻棒、大培养皿等）四、实验步骤1、过氧化物酶的提取取白菜、萝卜、梨称取植物材料各 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r min 离心 15 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。2、聚丙烯酰胺凝胶的制备（1）制作分离胶（浓度10%） pH8.9 Tris-HCl溶液：1.6ml 分离胶PAG溶液：2.4ml 蒸馏水：3.2ml 10%TEMED：80l AP：80l 将上述溶液充分混匀，立即全部倒入安装好的制胶玻板中，为使分离胶界面平整，可在倒入分离胶后约5min后在其表面沿高板缓慢均匀加入0.5ml蒸馏水并将电泳槽轻轻敲击桌面。再静置40min左右，让分离胶凝聚完全。 （2）制作浓缩胶（浓度2.4%） 浓缩胶配方（浓度2.4%）：pH6.7 Tris-HCl溶液：0.84 ml 浓缩胶PAG溶液：2.5ml 40%蔗糖溶液：2.5ml 10%TEMED：60l 10%AP：60l 将上述溶液充分混匀，在聚合完全的分离胶上，倒入浓缩胶，（注意在倒入浓缩胶前要去掉分离胶表层的水）同时插入梳子（9齿），直到溶液装满和梳子插平为止。再静置40min左右，浓缩胶聚合完全后为乳白色。 注意事项：A、在整个过程中要将制胶模具垂直方在桌面上，不容许倾斜。B、充分混匀的（分离胶/浓缩胶）溶液应尽快用移液枪延高板一侧慢慢加入胶板C、胶制作完成后，松开卡板取下橡胶皮，再用卡板卡紧胶板。注意低板在内侧。3、点样将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，上槽即加样槽（短板侧）缓冲液要求没过样品槽，下槽（长板侧）缓冲液要求没过电极，备用。用微量注射器（50L）吸取少量样液，在浓缩胶上层点样，点样量：白菜、萝卜、梨提取液各30L点样时须小心，防止样品液扩散。向上槽液中滴加0.1%溴酚蓝23滴。 4、电泳按上“”下“”接好电源线（上槽即加样槽为负极）。将电泳槽置于4冰箱（或接通电泳槽水冷却系统）。打开电源开关，调节电流到10mA左右，当样品进入到分离胶后加大到30mA，维持恒流。待溴酚蓝指示剂下行到距胶板末端1cm处，即可停止电泳。关闭电源，电泳约3h。5、剥胶取出胶板，去掉胶套，用微量注射器沿玻璃内面注入一定量水后即可掀开玻璃，去掉浓缩胶（注意先进行测量），将分离胶放入培养皿。 6、染色将配制好的染色液倒入培养皿，室温下染色110min后显示蓝色条带，后变红褐色。用去离子水漂洗，并拍照记录。7、记录酶谱，并计算各同工酶的迁移率（Rf值） 点样点到酶带的距离点样点到溴酚蓝前沿的距离Rf =点样点酶带溴酚蓝前沿方法二 比色法测定不同果蔬中过氧化物酶活性 一、原理 在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处有最大吸收，可用分光光度计测量470nm的吸光度变化测定过氧化物酶活性。 二、实验材料1、0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH7.6）2、反应混合液： 100mmol/L磷酸缓冲液（pH7.6）50mL于烧杯中，加入愈创木酚28L，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19L，混合均匀，保存于冰箱中。3、白菜、萝卜、梨新鲜材料若干三、实验设备分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100mL容量瓶，吸管，离心机四、实验步骤1、过氧化物酶的提取取白菜、萝卜、梨称取植物材料各 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r min 离心 15 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。2、取光径 1 cm 比色杯 4只，于 1 只中加入反应混合液 3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ，作为对照，另 3 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液各 1mL （如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次。 四、结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 A 470 /min g （鲜重） 表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.0