微生物学实验操作规范说明.doc

微生物学实验操作规范说明一、普通光学显微镜的正确使用方法1、遵循“低倍镜高倍镜油镜”的原则；2、利用同焦现象进行聚焦：装上待观察的玻片后，将低倍镜（4倍镜）转换到工作位，用粗调节将载物台上升到最高，再用粗调节反方向调节，初步聚焦后再用细调节聚焦，将目标物调到视野中心后才能转换10倍镜到工作位，此时将出现同焦现象，即不需要调节视野中就有目标物的模糊影像；紧接着就可以只通过细调节就可以聚焦，此后不允许再用粗调节进行聚焦，避免粗调节的误操作压迫玻片，损坏镜头；在10倍镜下聚焦后，又将目标物移到视野正中间，然后转换40倍镜头到工作位，继续利用同焦现象用细调节进行聚焦；聚焦后将目标物移到视野正中间，装上油镜，在不动载物台高度，也不拿下玻片的情况下用胶头滴管滴加香柏油，然后将油镜转换到工作位，利用同焦现象用细调节进行聚焦。3、聚焦注意事项：（1）初步聚焦后不允许再使用粗调节进行聚焦；（2）每次转换镜头之前，物象应该是最清楚的，而且应该将目标物移到视野正中心，否则可能不出现同焦现象；（3）记得再使用40倍镜和油镜前，检查镜头是否干净，若有堵塞或香柏油，应该用二甲苯进行擦拭。4、显微镜使用后的处理：（1）关掉电源，拿下玻片，用洗衣粉清洗干净后放入75%酒精瓶中浸泡；（2）卸下油镜，将油镜用二甲苯擦拭干净后装回塑料套中，放回干燥器中进行保管；（3）擦拭显微镜上的灰尘或油迹，将剩余的镜头摆回“八”字位；（4）在登记本上记录使用情况后，套上布套，将显微镜放回柜中。二、无菌器材的准备1、微生物实验过程中使用的各种器材均需要进行严格的灭菌。2、培养皿的包扎和灭菌：（1）培养皿应该干净干燥，一砸八个到十个，要按一致方向进行摆，用报纸进行包扎，要求培养皿全部包住，没有露出来的，两端报纸叠痕整齐美观，包好后用棉线进行捆绑，方便拎取；（2）培养皿也可以用专门的金属器皿进行包装；（3）培养皿灭菌可以采用干热灭菌，灭菌条件：160170，12h；也可以采用高压蒸汽灭菌，条件12120min；（3）灭菌后的培养皿应该放到烘箱进行干燥，干燥温度105，时间视情况而定，尽量多烘一段时间，保证干透，以免培养出来的菌落生长不规则；（4）烘干的培养皿在使用之前不应该打开包装；（5）在无菌室进行杀菌时，可以将烘干的培养皿放到无菌室或超净工作台上，连同无菌室一起进行消毒；（6）使用时，打开无菌培养皿，应该让培养皿一叠盖子在上底在下，一个方向放好。3、移液管的包扎和灭菌：（1）移液管在包扎前也应该是干燥的，若有水，应该进行干燥或者用力将水甩干净；（2）应该在移液管尾端塞入一截棉花，起到过滤空气阻留杂菌的作用；棉花应该是完整的一截，而不应该几截拼在一起；松紧应该合适，可以用牙签帮助塞棉花；塞完后，尾端不能有棉花丝露在外面，可以用酒精灯快速灼烧外面的棉花丝；（3）将塞好棉花的移液管按照不同量程规格分开包扎，可以一支一支包，也可多支一起包；（4）包扎时，应该先包管尖，打结在尾端，这样可以避免使用时错将管尖拆出来；（5）灭菌和烘干要求同培养皿；（6）使用移液管时，拆开包装，应从打结一段开始，避免手碰到刻度以下的部位。4、移液枪及枪头的灭菌：（1）移液枪有大小不同的量程，不同的量程要配不同规格的枪头；（2）移液枪不能放在高热下灭菌，不能放在烘箱或者杀菌锅中杀菌，只能用酒精擦拭表面，然后放在无菌台上进行照射消毒；（3）枪头在包扎前应该检查是否有水，有水的要甩干，然后放在合适规格的小盒中摆好，再将小盒包好，放进杀菌锅中进行杀菌；（4）杀完菌的枪头一定要冷却后才能使用，否则枪头温度过高，在使用时容易被捅弯；（5）枪头是可以重复灭菌使用的，用完的枪头不应该丢弃；（6）使用移液枪使应注意调节刻度，需要移取多少调到多少；使用时注意掌握力度，力度不能过大，刚好感觉到阻力时就应该停止下压，否则，移取的体积将不准确。5、试管的包扎和灭菌：（1）试管要配上合适大小的塞子；使用棉塞时严禁将试管倾倒；（2）多支试管包扎在一起时，应该用烧杯承托，而不能直接将多支试管包在一起，因为试管越多越不容易捆紧。极有可能因为其中一根松动，造成其他试管全部松动跌落而摔烂；（3）用烧杯承托试管安全得多，只需将试管连同烧杯口包扎起来就可以了。6、三角瓶的包扎和灭菌：三角瓶也应该配上合适大小的塞子，用牛皮纸包好瓶口。三、高压杀菌锅的使用方法（针对本实验室所使用的杀菌锅）1、正确的操作流程：检查水位加水摆放物品盖锅盖接通电源设置杀菌温度和时间点击“work”工作按钮杀菌（升温保温降温）切断电源开盖取出物品2、操作注意事项：（1）加水不可过多，不超过锅内平台，避免浸湿物品；（2）每次杀菌前一定要检查水位；（3）盖锅盖时应该对称拧紧三对螺母，避免一顺操作造成盖子一边紧一边松，不平衡而漏气；（4）盖完盖子后要检查盖上的两个阀门是否都闭上了，切忌没关上就离开，否则杀菌过程中温度无法上升到100度以上；（5）一定要按“work”工作按钮，否则杀菌锅是不会开始工作的；（6）杀菌锅报警后，没有特殊情况，不应过早放气，应该等待自然冷却；（6）压力表指针回零后方能开盖。四、无菌室的消毒1、无菌室应该保持清洁，应该在空间内装紫外灯，灯的多少应视空间大小而定；2、条件好的无菌室，进入室内的空气应该是经过空气滤器的，而不是直接进入室内；3、无菌室在使用前应该进行严格消毒和灭菌，擦拭无菌室桌面及拖地用水均应是消毒水，不应用自来水，严禁用普通的脏抹布及地拖打扫无菌室！4、对无菌室进行照射消毒之前，应该将杀过菌但未拆包装的物品摆放到无菌室或超净工作台上一并进行杀菌；5、摆好物品后，先开超净工作台上的紫外灯，然后快速离开无菌室，在室外打开无菌室空间的紫外灯进行照射；6、照射时间一般为20min30min；7、照射结束后，先关空间紫外灯，然后才能进入无菌间，再关超净工作台上的紫外灯，切忌一定要将超净工作台上紫外灯关掉后才能进行实验操作，若一直开着紫外灯而没有发觉，在不知情的情况下长时间在超净工作台上操作时，紫外线会灼伤皮肤及眼睛，这种伤害严重的时候不可修复！8、在无菌室内，进门的地方，可以摆75%酒精喷壶，用于实验操作人员的双手消毒。五、培养基的配制与灭菌1、培养基的配制应遵照每一种培养基的配方进行配制，方法优先按照培养基配制说明进行，没有明确说明的情况下，可以按照培养基配制的一般流程进行；2、对于含有琼脂的培养基，一定要将培养基煮沸，使琼脂完全溶解，否则可能会因为琼脂没有溶解，过滤时去除了一部分琼脂而导致培养基不能凝固或者凝固后强度不够；也可能使琼脂分装不均匀，而使每支试管培养基凝固的情况不一样；3、培养基的分装应严格按照书本规定进行；4、应对每种培养基进行标记，相互区别，以免发生混乱；标签上最重要的信息是培养基的名称和配制的时间；5、培养基灭菌条件为1211520min，不能采用干热灭菌法，原因是干热温度高，时间长，破坏了培养基的营养成分；6、杀完菌的培养基未开封可以在冰箱中保存1周，一周后就不能再用！凝固了的培养基可以用水浴、微波炉进行溶解，也可以用电炉直接加热，但用电炉直接加热时，必须垫上石棉网，并且火力不能太高，要经常摇晃三角瓶，使传热更均匀；溶解一定要充分，使琼脂彻底溶解，否则，倒平板后，平板将不平，甚至有大块未融化的琼脂。7、摆斜面的培养基应该在杀完菌后趁热立即摆斜面，斜面长度不超过试管总长的一半。8、配制培养基时，要调节pH值，若需要加入有颜色的成分，应该在加入有颜色的成分之间就调节pH值。六、倒平板的规范操作1、准备工作：应穿上白大褂，带上口罩，进入无菌室，先用酒精清洁双手，然后将物品合理摆放，左手用的东西放在左边，右手用的东西放在右手边，禁止跨过酒精灯取东西；然后用酒精棉球从中心到周围清洁台面，将酒精灯放在正中间，点燃酒精灯；再清洁一遍双手，才可以进行操作。2、待培养基冷却到适宜的温度（50度左右，保持液态，而不烫手）时，解开三角瓶的包扎纸，右手拿起三角瓶，灼烧瓶口后在无菌区开塞，塞子若不盖回，可以将塞子放在牛皮纸中；若塞子还需要盖回来，需将塞子带在手上，这时应是左手拿起三角瓶，灼烧瓶口开塞后，将塞用右手小拇指夹住，然后转瓶尾，保持瓶口在无菌区，将瓶子换到右手，手应该握在瓶底而不应该握在瓶口；然后将瓶口保持在无菌区，左手拿起一个平板，开盖前过一下火，在无菌区打开皿盖，往皿中倾倒1520ml培养基，在无菌区盖上盖子，从台边缘将平皿快速放到台面，然后轻轻摇匀，放定，在凝之前不要再挪动平皿，否则培养基表面可能不平。七、微生物的接种1、斜面传代移种：右手持接种环，打横过火后集中灼烧接种环，至接种环端发红；左手拿菌种管，过火后开塞，塞子带在右手，接种环在管内壁冷却后轻轻取一环菌，过火封塞，将菌种管放回，再取接种管，过火开塞后，将接种环由底端开始走S线上来，过火封塞，即完成接种。要求接种量不能过多，否则可能带入较多的变异菌株。也可以同时将菌种管和接种管拿在左手上，菌种管在前接种管在后。2、斜面菌种向液体培养基接种：在斜面菌种管取菌后，左手拿液体管，过火开塞后，将接种环伸入液体培养基搅动几下，若菌种较难进入液体，可以将接种环在管壁上研磨；过火封塞后振摇试管，使菌种分散均匀。3、划线分离的操作注意事项：（1）避免划破培养基；（2）良好的分离效果是要保证分离出单个菌落，并且菌落应该从多渐少，呈梯度分布；（3）用划平行线的方法操作是，每一组平行线划完后应该灼烧接种环，相邻组的平行线应该交叉；最后一笔不烧接种环，也不与别的线交叉；（4）平行线的长度和距离应该合适，应该充分利用平板的有限面积。4、涂布分离的注意事项：（1）样液应该进行充分稀释，保证能分离得到单菌落；（2）用涂布器时，若涂布器经过灼烧，应该待涂布器充分冷却后才能进行涂布，避免太烫破坏培养基；（3）涂布时应该均匀，不要碰平皿边缘。八、移液管的使用和标准的移液操作（1）将干净的移液管放在左边，单支包扎的用一支拆一支；多支包扎的只能拆开尾端，将整扎连同报纸放在一起；（2）左手拿起移液管交给右手，同时过一次火，然后左手拿起试管，过火后开塞，塞带在右手，将试管放在无菌区后，左手拿起洗耳球，进行移液，移好后将洗耳球放下，注意洗耳球应该尖端朝上放置而不应该随手乱丢；（3）过火封塞后，再拿起要放液的新试管，过火后开塞，注入液体；（4）标准的动作是右手拿移液管，左手拿洗耳球；移液管放液的时候不能接触液体培养基；没有吹字的移液管不能吹，由于有塞棉花，所以放液后应该稍微停留一下，等待液体全部放出。九、梯度稀释液的制备1、无菌取样；2、每次做完一个稀释，应该充分摇匀后才能取样进行下一个梯度的稀释。十、培养1、平皿应该翻转后进行培养，避免凝结水反滴到培养基表面，使菌落生长不规则；2、培养皿应该插花堆放，而不应该一叠叠堆放，目的是为了传热均匀；3、培养皿不要放在靠壁和散热孔附近，避免温度高而被烤干；4、试管应该保持直立进行培养，而不应该倒放，避免凝结水反流；5、应该严格按照培养条件进行培养，时间到了应该尽快终止培养，否则结果不准确，或者菌体老化自溶.考核要素评分要素评分细则菌的鉴别10分菌落形态、色泽观察对菌的特征熟悉