陇南地区不同海拔区域内小麦条锈菌群体遗传多样性的分.doc

Vol.28 No.4 505/jwxtcn陇南地区不同海拔区域内小麦条锈菌群体遗传多样性的分析陆宁海1,2 王建锋1,2 詹刚明1 黄丽丽1 康振生1,2*1西北农林科技大学植物保护学院 杨凌 7121002西北农林科技大学 陕西省农业分子生物学重点实验室 杨凌 712100摘 要：小麦条锈病是世界范围内小麦上最重要的流行性病害之一，可造成严重的产量损失。陇南地区是我国小麦条锈菌主要越夏易变区和新小种发源地，了解该地区不同海拔高度区域内条锈菌遗传多样性有重要意义。本研究采用TP-M13-SSR 荧光标记技术对11个种群330个小麦条锈菌分离株基因组DNA进行了SSR标记分析。不同海拔区域的条锈菌遗传多样性有明显的差异，高山区的遗传多样性比较丰富，半山区次之，川道区相对比较低。不同生态区域内，小麦条锈菌群体遗传分化程度不同，高山区和半山区遗传分化程度大，基因流小，川道区群体遗传分化程度比较小，基因流大。来自不同海拔区域的菌系具有相同的基因型， 这一结果从分子水平证明了在陇南地区小麦条锈菌在山区与川地之间存在广泛的菌源交流, 可就地完成周年循环。关键词：小麦条锈菌，遗传分化，海拔，SSR标记SSR analysis of population genetic diversity of Puccinia striifornis f. sp. tritici in different altitude regions of Longnan, GansuLU Ning-Hai1, 2 WANG Jian-Feng1, 2 ZHAN Gang-Ming1 HUANG Li-Li1 KANG Zhen-Sheng1, 2*1College of Plant Protection, Northwest Agriculture & Forestry University, Yangling 712100, China2Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology, Northwest Agriculture & Forestry University, Yangling 712100, ChinaAbstract: Stripe rust (or yellow rust) of wheat (Triticum aestivum), caused by Puccinia striiformis f. sp. tritici, is one of the most important diseases of wheat worldwide. It is very important to research the population genetic diversity of P. striifornis f. sp. tritici in different altitude regions of Longnan, one of the largest and the most important over-summering areas in China. Using the TP-M13-SSR, population genetic diversity and variation of P. striiformis f. sp. tritici, containing 330 isolates 11 collections from different altitude area of Longnan, were investigated. The important conclusion is that P. striifornis f. sp. tritici populations from different altitude areas were genetically different. Genetic diversity for the pathogen population from high mountainous area is much higher than that from mountainside area or lowlands. The genetic differentiation for the populations obtained from high mountain and mountainside areas was higher than that of the population from the lowlands, suggesting the limited gene flow in mountain area, and extensive gene exchange in lowlands. Our molecular data confirm that the stripe rust pathogen is able to exchange between lowland areas and high mountain areas in the region.Key words: stripe rust of wheat, genetic differentiation, SSR marker, altitude小麦条锈病是由小麦条锈菌Puccinia striiformis f. sp. tritici引起的气流传播性病害，遍及世界各主要麦区，也是我国小麦上最重要的病害和主要监控研究对象。甘肃陇南小麦条锈病流行区，包括天水地区渭河流域、嘉陵江上游徽成盆地与四川接壤的白龙江流域，境内地势复杂，有川地、半山区、高山区，小麦种植在海拔8002400m均有分布，是中国小麦条锈菌最重要的越夏区之一。小麦条锈菌主要在这些地区高海拔山区的自生麦苗上越夏，在半山区和川地越冬，可就地完成周年循环，有利于其发生毒性变异并易于保存，是我国小麦条锈菌新小种的策源地。该区秋季的菌源可向东部广大冬麦区传播，越冬后春季菌源可向北部和西部麦区蔓延，对周边地区有重要影响（李振岐和曾士迈 2002）。随着分子生物学的发展，尤其是分子标记技术的出现为条锈菌的研究提供了有效工具。Enjalbert et al.（2002，2005）首先报道了由小麦条锈菌基因组筛选出的12个微卫星标记；随后应用于法国南部和北部条锈菌群体的遗传分化研究，揭示了虽然它们都具有严格无性系群体的特征而且地理距离也不遥远，却明显存在地理群体差异。Hovmller et al.（2008）用AFLP标记鉴定了两个条锈菌新菌系，并发现这两个菌系在全球快速传播。Markell & Milus（2008）通过AFLP标记从美国东部条锈菌旧群体中鉴定出两个新群体，且新群体菌系的致病性强，产孢量大。Shan et al.（1998）利用小麦条锈菌基因组特异重复序列（Puccinia striiformis repeat，PSR）为探针对160个采自全国六省的小麦条锈菌标样进行了遗传多样性分析，表明条锈菌群体存在很高的遗传多样性，不同地区之间存在差异。郑文明等（2005）应用PSR探针对采自我国条锈菌越夏关键区甘肃天水地区的224个标样进行了指纹分析，表明该地区群体内存在丰富的遗传多态性。目前，国际上采用AFLP和SSR标记技术对小麦条锈菌群体结构的研究相当广泛，但对中国小麦条锈菌流行关键地区甘肃陇南较大样本的SSR遗传多样性分析尚无报道。本研究拟采用微卫星（Microsatelite）标记方法对陇南地区不同海拔高度的地区内小麦条锈菌群体遗传多样性进行研究，了解不同海拔高度区域内小麦条锈菌群体的遗传结构和分化程度，明确海拔高度对小麦群体遗传多样性的影响。1 材料与方法1.1 小麦条锈菌群体标样的采集本研究于20062007年在甘肃省陇南地区进行了小麦条锈菌标样的采集，包括米仓山、高楼山、横岭山、凤凰山、云台山，共获得330个标样（表1和图1）。选取发病较轻，严重度较低，条锈菌夏孢子较为新鲜饱满，叶片较整洁，病斑布局较清晰的标样进行采集，用吸水纸将标样分离包装，在采样过程中标样在合适温度下短期干燥保存，回到实验室如不能立即接种，在干燥器中4保存。1.2 小麦条锈菌的繁殖与保存提前710d种植小麦感病品种铭贤169，选取饱满的种子，每花盆播10粒，待麦苗第一片叶完全展开后，每盆保留麦苗6株。接种前一天清洗条锈菌标样，冲洗掉叶片表面的杂质，置于铺有滤纸的保湿盘中保湿15h，温度为1315。在接种前对小麦进行脱蜡处理，以利于条锈菌更容易侵染扩展。将保湿处理过的条锈菌标样取出，用接种针挑取单孢子堆轻涂于叶片表面，接种后清水喷雾，置于保湿桶黑暗保湿24h，温度为1315，然后转移至适宜环境内潜育发病。叶片出现花斑后，剪去多余心叶，每花盆只保留1株发病最好的植株，加表1 小麦条锈菌标样的采集地点、数目和海拔高度Table 1 The location, altitude, code and number of samples of Puccinia striiformis f. sp. tritici collected from Longnan in Gansu采样地点Location数量Number of isolates海拔（m）Altitude (m)编码Code高山区High mountain高楼山 Gaolou mountain301700-2000GL米仓山Micang mountain30MC齐寿山 Qishou monutain30QS半山区Middle mountain凤凰山 Fenghuang mountain301500-1700FH云山 Yun mountain30YS横岭山 Hengling mountain30HL平南 Pingnan 30PN川道区Lowlands红川 Hongchuan江洛 Jiangluo渭南 Weinan 中滩 Zhongtan301100-1500CX30HX30WN30ZT上隔离罩，防止交叉污染。接种后约1315d，接种叶片即开始产生夏孢子。分别用收集管收集每株发病叶片上的孢子，直至病叶不再产孢。收集的菌种抽真空封存，-70备用。1.3 基因组DNA提取方法基因组DNA的提取参照 Wang（2007）的方法加以改进：取510mg新鲜小麦条锈菌夏孢子于1.5mL eppendorf离心管中，加入抽提缓冲液50L；用电钻加研磨棒研磨样品（冰上操作），再加入300L抽提缓冲液，涡旋混匀；每管加30L 20%的SDS、20L 5mol/L NaCl和30L CTAB/NaCl 溶液，颠倒混匀，65温育1h（20min颠倒一次）；加等体积（350L）的苯酚：氯仿：异戊醇，轻轻颠倒混匀，4、12,500r/min离心12min；取上清液，加300L的氯仿，轻轻颠倒混匀后4、12,500r/min离心10min；取上清液加入等体积的异丙醇（预冷），-20放置12h；4、13,000r/min 离心15min，弃液体，加70% 乙醇（预冷）400L清洗两次，每次洗后4离心10min，然后室温干燥；加30L TE，置4溶解，-20保存。加4L RNaseA 酶37温育34h，加等体积的氯仿颠倒混匀后，4、10,000r/min离心，取上清液-20保存。采用ND-1000 UV-Vis微量紫外/可见分光光度计（NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer）测定DNA纯度和浓度。将提取的模板DNA稀释为50ng/L待用。1.4 TP-M13-SSR体系的SSR引物和M13荧光引物的合成本研究采用了11对SSR引物，每对引物的正链进行了荧光标记。其中，RJ18、RJ20、 RJ21、RJ24和RJ27引用Enjalbert et al.（2002）；CPS15、CPS34、CPS36、 CPS08、CPS09和CPS10是本课题组设计开发的（Chen et al. 2008）。TP-M13-SSR （Tailed Primer-M13-SSR）引物的合成，在TP-M13-SSR 检测系统中，用3条引物来进行PCR扩增。第1条引物是把供试的SSR引物对中的正向引物和M13的正向引物相连接合成带有M13尾巴的引物，称之为TP-M13；第二条引物是正常的SSR反向引物；第三条引物是带有IRDye 800荧光标记的M13正向引物（IR-labeled M13 primer）。IR-labeled M13 primer（IRD800）由美国LICOR 公司合成，其他非荧光普通引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.5 TP-M13-SSR PCR扩增条件TP-M13-SSR反应体系10L，参考LICOR-4300 Tailed Primer PCR Protocol（Genetic Analysis Manual）：10反应缓冲液（Applied Biosystems）1.0L，MgCl2（25mmol/L, Applied Biosystems）0.8L，dNTPs（2.5mmol/L, Roche）1.0L，TP-M13（10mol/L）0.5L，反向引物（10mol/L）0.5L，IR-labeled M13 引物（10pmol/mL）0.5L，Taq聚合酶（5U/L, Applied Biosystems）0.15L，模板DNA（50ng/L）1.0L，ddH2O 4.55L。图1 陇南地区小麦条锈菌采样图 FH，凤凰山；GL，高楼山；HC，红川；HL，横岭山；JL，江洛；MC，米仓山；PN，平南；QS，齐寿山；WN，渭南；YS，云山；ZT，中滩.Fig. 1 Locations of Puccinia striiformis f. sp. tritici isolates in Longnan of Gansu Province, China. The two letters indicate the names of the sampling locations (see Table 1). FH, Fenghuang Mountain; GL, Gaolou Mountain; HC, Hongchuan; HL, Hengling Mountain; JL, Jiangluo; MC, Micang Mountain; PN, Pingnan; QS, Qishou Mountain; WN, Weinan; YS, Yun Mountain; and ZT, Zhongtan.扩增反应在PTC-200（BIO-RAD）上进行，PCR扩增反应程序：94变性 4min；94变性45s，64退火45s，每循环一次降0.7，72延伸45s，10个循环；94变性45s，54退火45s，72延伸45s，25个循环；72延伸10min，4终止反应。1.6 PCR扩增产物的电泳检测荧光标记引物扩增的产物经6.5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，分子量标准选用荧光标记DNA Marker 50-700 Sizing Standard。电泳过程在LICOR-4300 DNA自动分析仪（LICOR Biotechnology Division, Lincoln, NE）上进行。1.7 统计分析利用POPGENE version 1.32软件（Yeh 1997）计算以下参数： 多态性条带数NP（Number of polymorphic loci），多态带百分率P ( Proportion of polymorphic loci)，有效等位基因数Ne（Effective number of alleles），基因多样性指数H（Gene diversity），Shannon信息指数I（Shannons information index），Nei的遗传距离GD（Genetic distances），遗传分化系数Gst。利用Arlequin3.11软件中的AMOVA (Analysis of Molecular Variance)进行分子方差分析，统计群体间和群体内的方差、方差分量及贡献率，依此量化评价基因多样性在群体间和群体内的差异和贡献。NTSYSpc-2.11F 软件进行数据分析，用SHAN程序中的UPGMA（Unweighted Pair-Group Mean Average, 非加权算术平均聚类）方法进行聚类分析，并通过Tree plot 模块生成聚类图。2 结果与分析2.1 SSR引物的PCR扩增结果11对SSR引物在350个分离株基因组中共扩增出40个位点，其中多态性位点38个，多态性百分率为95.0%。各引物所揭示的遗传多样性水平不尽相同，其中引物CPS09和RJ24扩增出的条带较多，CPS15、CPS36和RJ27扩增的条带较少，平均每一对引物扩增出值为3.64个条带，3.45个多态性条带。2.2 小麦条锈菌群体遗传多样性水平在高山区，各群体的遗传多样性水平有显著的差异，高楼山条锈菌群体遗传多样性相对较高，有效等位基因数目（Ne）为1.39，Neis（1973）基因多样性指数（H）为0.25，Shannon 信息指数 (I) 为0.36，扩增出33个等位基因位点，其中多态性百分率为82.5%。米仓山锈菌群体次之，齐寿山的条锈表2 小麦条锈菌群体遗传多样性水平Table 2 Genetic diversity parameters of Puccinia striiformis f. sp. tritici in three geographical region of Longnan in China群体Population亚群体Sub-populationNe aH bI cNP dP% e高山区High mountain高楼山 Gaolou mountain1.390.250.363382.5米仓山Micang mountain1.380.230.352972.5齐寿山 Qishou mountain1.320.200.302972.5物种水平Species level1.440.270.423895.0半山区Mountainside凤凰山 Fenghuang mountain1.350.210.333075.0云山 Yun mountain1.390.230.352870.0横岭山 Hengling mountain1.400.230.352870.0平南 Pingnan1.360.220.333075.0物种水平Species level1.410.250.383587.5川道区Lowlands红川 Hongchuan1.360.220.332665.0江洛 Jiangluo1.330.210.332767.5渭南 Weinan1.290.180.272562.5中滩 Zhongtan1.310.190.282665.0物种水平Species level1.400.240.363280.0注：aNe，有效等位基因数目；bH，Neis (1973)基因多样性指数; cI，Shannon 信息指数；dNP, 多态性位点数; dP%, 多位点带百分率.Note: aNe, effective number of alleles; bH Neis (1973), Neis gene diversity; cI, Shannons Information index; dNP, number of polymorphic loci; dP%, percent of polymorphic loci.菌群体遗传多样性相对较低。在半山区，各群体的遗传多样性水平没有显著的差异，Neis（1973）基因多样性指数（H）为0.210.23，Shannon 信息指数 (I)为0.330.35。在川道区，各群体的遗传多样性水平有一定的差异，红川和江洛锈条菌群体遗传多样性相对较高，Neis（1973）基因多样性指数（H）分别为0.22和0.21，Shannon 信息指数 (I) 均为0.33，渭南和中滩的条锈菌群体遗传多样性相对较低，各遗传多样性参数没有差异。在物种水平上，不同海拔区域的条锈菌遗传多样性有明显的差异，高山区的遗传多样性比较高，有效等位基因数目（Ne）为1.44，Neis（1973）基因多样性指数（H）为0.28，Shannon 信息指数 (I) 为0.42，扩增出38个等位基因位点，其中多态性百分率为95.0%。半山区条锈菌遗传多样性次之，川道区条锈菌遗传多样性相对比较低，有效等位基因数目（Ne）为1.40，Neis（1973）基因多样性指数（H）为0.24，Shannon 信息指数 (I) 为0.36，扩增出32个等位基因位点，其中多态性百分率为80.0%（表2）。表3 不同海拔区域内小麦条锈菌群体遗传分化及基因流Table 3 Genetic differentiation and gene flow of Puccinia striiformis f. sp. tritici within and among geographical regions in Longnan, ChinaHt aHs bDst cGst dNm e高山区High mountain0.27 0.21 0.06 0.23 0.83半山区Mountainside0.25 0.20 0.05 0.21 0.95川道区Lowlands0.24 0.21 0.03 0.13 1.67群体 Population0.26 0.22 0.04 0.15 1.42注: aHt, 总的遗传多样性; bHs, 群体内的遗传多样性; cDst, 群体间的遗传多样性; dGst, 遗传分化; eNm, 基因流.Note: aHt, denote gene diversity in the species; bHs, gene diversity within populations; cDst, gene diversity among populations; dGst, population genetic differentiation; eNm, gene flow.2.3 小麦条锈菌群体遗传分化 不同海拔高度区域内，小麦条锈菌群体遗传分化程度不同，高山区和半山区遗传分化程度大，基因流小，川道区小麦条锈菌群体遗传分化程度比较小，基因流大（表3）。其中，川道区SSR标记系表4 种群间和种群内分子变异的AMOVA分析Table 4 Analysis of molecular variance (AMOVA) of Puccinia striiformis f. sp. tritici on the basis of SSR data for the 11 populations from the three areas in Longnan, China变异来源Source of variance自由度DFa平方和SSb变异组分VCC总变异百分率 (%)PVd (%)F-测验F-statisticsP值P value区域间 Among areas381.670.071.28FCT:0.010.2972区域内种群间 Among populations within areas8401.231.424.21FSC:0.240.001群体内 Within populations3181546.554.4774.51FST: 0.220.001总计Total3292029.455.94100.00注：aDF：自由度；bSS：平方和；CVC：变异组分；dPV%：总变异百分率.Note: aDF= degree of freedom; bSS = sum of squares; CVC = variance components; dPV (%) = percentage of variation.图2 不同海拔区域内的小麦条锈菌群体的聚类分析图Fig. 2 UPGMA dendrogram based on SSR data of Puccinia striiformis including 11 populations from three areas of Longnan in Gansu Province, China.统揭示的总的遗传多样度（Ht）和群体内的遗传多样度（Hs）分别为0.24和0.21，群体间遗传多样度（Dst）为0.03，遗传分化系数（Gst）为0.13，群体内变异占总变异的87%，基因流（Nm）为1.67，表明群体之间菌源相互交流十分频繁。同时，不同海拔高度区域间，条锈菌群体存在遗传分化现象，遗传分化系数（Gst）为0.15，表明群体内变异占总变异的85%，基因流（Nm）为1.42，表明不同海拔区域间群体之间也存在菌源交流。利用Arlequin软件中的AMOVA方法分析结果也表明，不同生态区域间的遗传分化为1.28%，区域内的种群间的遗传分化为24.21%，遗传变异主要来自群体内部，占总变异的74.51（表4）。2.4 聚类分析聚类结果表明，陇南地区不同海拔高度区域内的小麦条锈菌群体聚为两个大的类群， Group A由江洛、红川、凤凰山、中滩、渭南、齐寿山等种群组成，Group B由云山、米仓山和高楼山种群组成，其中Group A又分为两个亚群Subgroup，Subgroup A由江洛、红川等种群组成，Subgroup B为齐寿山种群组成（图2）。有意思的是来自川道区的条锈菌群体均聚为一个亚群，表明他们遗传距离较小，相似性程度高，基因的交流广泛，没有受到地理的阻隔。同时，来自川道的种群和半山的种群，遗传距离较小，相似性程度较高，有一定的基因流存在。高山区的种群和半山区的种群遗传相似性较高，高山种群与川道种群的相似性比较低，基因的流动或飘逸受到一定程度的地理阻隔。3 讨论国内外研究表明，小麦条锈菌群体遗传结构受自然选择、遗传漂变、交配系统、基因流和寄主等因素的共同作用，同时，不同的生态环境也可以影响条锈菌的群体遗传结构和多样性（Hovmller et al. 2008）。小麦条锈菌至今没有发现有性世代的存在，在通常情况下个体之间无基因交流，生殖上是隔离的，条锈菌这一特点并不利于其产生遗传变异，然而对自然群体的遗传多样性分析发现它存在较高的多态性水平，这些变异可能来自突变、异核现象或准性生殖，甚至存在有性杂交的可能（Enjalbert et al. 2005）。不同海拔区域的条锈菌遗传多样性有明显的差异，高山区的遗传多样性比较高，半山区遗传多样性次之，川道区遗传多样性相对比较低，这一结果与郑文明等（2005）报道的天水地区高海拔的山区比低海拔川道区小麦条锈菌遗传多样性高一致。形成这一现象的原因可能与条锈菌的越冬越夏条件有关，在海拔1600m以上的山区，夏季气温较低，条锈菌可顺利越夏，甚至既可越冬又可越夏（李振岐和曾士迈 2002），在此条件下，病原菌经异核作用即重组产生新菌系（康振生等 1994），增加了其变异即遗传多样性，在本研究中，SSR标记也揭示了病原菌重组现象的存在。另外，高海拔地区高强度的紫外线和射线也可能造成锈菌群体的高突变率，如果这些突变得以顺利保存和传播，则可能会明显地丰富该区域条锈菌群体的多样性。同时，高山区、半山区和川道区种植的小麦品种及面积、种植的时间、种植的方式及管理的方式不同，这些可能的因素也可造成小麦条锈菌群体结构的不同。不同海拔高度区域内，小麦条锈菌群体遗传分化程度不同，高山区和半山区遗传分化程度大，基因流小，川道区小麦条锈菌群体遗传分化程度比较小，基因流大。基因流对于一个遗传结构的影响是，基因流传播愈顺畅，遗传分化的程度将愈低。本研究中，高山区条锈菌群体之间可能在一定程度上受到地理的阻隔，基因的流动或漂移不顺畅，导致其遗传分化程度较高。川道区，由于相对比较地势平坦，条锈菌基因的流动几乎没有受到地理的阻隔，所以其遗传分化程度较低。同时，本研究表明在不同海拔区域间，也存在基因的交流，基因流Nm为1.42。本研究的重要发现是，4个高楼山菌系，5个齐寿山菌系，9个凤凰山菌系，5个云山菌系，9个横岭山菌系，7个平南镇菌系，13 个红川菌系，9个江洛菌系和4个中滩菌系具有相同的基因型，这一结果为小麦条锈菌在高海拔山区和半山的自生麦苗上越夏，川地越冬，可就地完成周年循环，提供了分子证据。REFERENCESChen CQ, Zheng WM, Huang LL, Lu NH, Kang ZS, 2009. 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