基因工程题库以及答案.doc

一、填空题1 基因工程是_年代发展起来的遗传学的一个分支学科。2 基因工程的两个基本特点是： (1)_，(2)_。3 基因克隆中三个基本要点是：_；_和_。4 通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小 的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的_。5 限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_，第二、三两个字母取自_，第四个字母则用_表示。6部分酶切可采取的措施有：(1)_(2)_ (3)_等。7第一个分离的限制性内切核酸酶是_；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_。8限制性内切核酸酶BsuRI和Hae的来源不同，但识别的序列都是_，它们属于_。9DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性： (1)_； (2)_的活性。10为了防止DNA的自身环化，可用_去双链DNA_。11EGTA是_离子螯合剂。12测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_酶的活性，而没有_酶的活性。13切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_的_和_的作用。14欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_或_。15反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有_的作用，可以将DNA-RNA杂种双链中的_水解掉。16基因工程中有3种主要类型的载体： _、_、_。17就克隆一个基因(DN*段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：_、_、_。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 18 一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫 。19 pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于 ，它的四环素抗性基 因来自于 ，它的氨苄青霉素抗性基因来自于 。20YAC的最大容载能力是 ，BAC载体的最大容载能力是 。21pSCl01是一种 复制的质粒。22pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 和 两种质粒改造而来。它的复制子来自 ，Amp抗性基因则是来自 。23噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是 ； 二是 。24 野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是 和 。25 黏粒(cosmid)是质粒噬菌体杂合载体，它的复制子来自 、COS位点序列来自 ，最大的克隆片段达到 kb。26 野生型的l噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。27噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是 ，而来自噬菌体的主要结构是 。28l噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DN*段后，总的长度应在噬菌体基因组的 的范围内。29 在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 。30 用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的阳离子，如NaCl和NaAc，其目的是 。31 引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1) (2) (3) (4) 。32Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的 。33在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在 。34乙醇沉淀DNA的原理是 。35 假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：(1)_ (2)_(3)_。36 受体细胞的感受态是_。37 DNA重组连接的方法大致分为四种：(1)_(2)_(3)_(4)_。38 将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个_，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个_。39将含有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称作一个_，源于同一批RNA制备物的克隆群则构建了一个_。40只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用_可以将这段DNA进行百万倍的扩增。41人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为_时吸附DNA, _时摄人DNA。42目前，在重组体的筛选中，已经发展了许多构思巧妙、具有极高准确性的筛选方法。大致可以分为： (1)_(2)_(3)_(4)_等。43PCR扩增筛选重组体是比较简便的筛选方法，它适合于_。44 核酸杂交探针可分为两大类： DNA探针和RNA探针。其中DNA探针又分为_ 探针和_探针。45如果用限制性内切核酸酶切割双链DNA产生5突出的黏性末端，则可以用_进行3末端标记。如果用限制性内切核酸酶切割DNA产生的是3突出的黏性末端，可以用_进行3末端标记。46单链DNA探针的标记可以采用下列方法：(1)_(2)_(3)_。47根据Northern杂交的结果可以说明：_。48差示杂交(differential hybridization)技术需要_。49RNA分子经凝胶电泳后按大小不同分开，然后被转移到一张硝酸纤维素膜(尼龙膜)上，同一放射DNA探针杂交的技术称_。50在_技术中，DNA限制性片段经凝胶电泳分离后，被转移到硝酸纤维素膜(或尼龙膜)上，然后与放射性的DNA探针杂交。51可用T4 DNA聚合酶进行平末端的DNA标记，因为这种酶具有_和_的活性。52根据外源片段提供的遗传表型筛选重组体，必需考虑三种因素： (1)_(2)_(3)_。53Northern印迹和Southern印迹有两点根本的区别：(1)_(2)_。54放射免疫筛选的原理基于以下三点： (1)_(2)_ (3)_。答案1702(1)分子水平上的操作；(2)细胞水平上的表达3克隆基因的类型；受体的选择；载体的选择4限制性酶切图谱5属名的第一个字母；种名的前两个字母；株名6(1)减少酶量；(2)缩短反应时间；(3)增大反应体积7EcoK；EcoRl8GGCC；异源同工酶9 枯草杆菌蛋白酶；(1)5-3合成酶的活性；(2)3-5外切核酸酶10碱性磷酸酶；5端的磷酸基团11 Ca2+12 5-3合成； 3-5外切13 DNA聚合酶I：5一3外切核酸酶；5一3合成酶14S1核酸酶切割；DNA聚合酶补平15核酸水解酶H；RNA16 质粒DNA；病毒DNA；质粒和病毒DNA杂合体17 复制区： 含有复制起点；选择标记： 主要是抗性基因；克隆位点： 便于外源DNA的插入18 质粒消除(或治愈)19， pMBl； pSCl01；pSF2124(R质粒)20 1000kb；300kb21. 严紧22 pBR322和M13；pMBl；转座子23 它在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA的扩增；对某些噬菌体(如l噬菌)的遗传结构和功能研究得比较清楚，其大肠杆菌宿主系统的遗传也研究得比较详尽 24 没有合适的限制性内切核酸酶识别位点；选择标记25质粒；l噬菌体； 4526 (1)分子量大，(2)酶的多切点，(3)无选择标记27复制区； IG区287510529 螯合Mg2+离子，抑制核酸酶的活性30 中和DNA分子的负电荷，增加DNA分子间的凝聚力31(1)合成探针；(2)合成cDNA；(3)用于PCR反应；(4)进行序列分析32T载体33第二链合成时形成的发夹环34乙醇使DNA分子脱水35(1)保持正确的可读框 (2)能够使其转录的启动子 (3)具有翻译的起始和终止信号36接受外源DNA的生理状态37(1)黏性末端连接； (2)平末端连接； (3)同聚物接尾连接； (4)接头连接法38 基因组DNA克隆； 基因组DNA文库39cDNA克隆；cDNA文库40聚合酶链式反应(PCR)410C；42C42(1)遗传学方法； (2)物理筛选法； (3)核酸杂交法； (4)表达产物分析法43插入外源片段的种类较多，大小又极为相似的重组体的筛选44基因组DNA；cDNA45Klenow酶填补的方法；T4DNA聚合酶46(1)用M13噬菌体载体合成单链DNA探针；(2)从mRNA反转录合成单链cDNA探针；(3)用不对称PCR合成单链DNA探针47外源基因是否进行了转录48两种不同的细胞群体能够表达不同的基因，即在一个群体中能够表达一些基因，而 在另一个细胞群体中不能表达这些基因49Northern印迹50Southern印迹5153合成酶；3 5外切核酸酶52(1)克隆的是完整的基因；(2)使用的是表达载体；(3)不含内含子53(1)印迹的对象不同：Northern是RNA，Southern是DNA；(2)电泳条件不同，前者是变性条件，后者是非变性条件54(1)抗体能够被吸附到固体支持物上；(2)同一个抗原可以同几种抗体结合； (3)抗体能够被标记二、选择题(单选或多选)1 因研究重组DNA技术而获得诺贝尔奖的科学家是( )AKornberg WGilbert PBerg BMcClintock2 第一个作为重组DNA载体的质粒是( )pBR322 ColEl pSCl01 pUCl83 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当。由作用于同一DNA序列的两种酶构成这一系统中的核酸酶都是类限制性内切核酸酶这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统4型限制性内切核酸酶： ( )有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供限制性识别非甲基化的核苷酸序列 有外切核酸酶和甲基化酶活性仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供5下面有关限制酶的叙述哪些是正确的?( )限制酶是外切酶而不是内切酶限制酶在特异序列(识别位点)对DNA进行切割同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同的一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNA，产生黏末端一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA，产生平末端6第一个被分离的类酶是： ( ) EcoK Hind Hind EcoB7在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好?( )反应时间 酶量 反应体积 酶反应的温度8在下列试剂中，那一种可以螯合Ca2+离子?( )EDTA 柠檬酸钠 SDS EGTA9在下列工具酶中，那一种可以被EGTA抑制活性?( )S1单链核酸酶 末端转移酶 碱性磷酸酶 Bal 31核酸酶10限制性内切核酸酶可以特异性地识别： ( )双链DNA的特定碱基对 双链DNA的特定碱基序列特定的三联密码 以上都正确11下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中，正确一项的是( )。Sau3A I EcoRI hind III Sau 3A112限制性内切核酸酶的星号活性是指：( )在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性。 活性大大提高切割速度大大加快 识别序列与原来的完全不同13下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?( )甘油含量过高 反应体系中含有有机溶剂含有非Mg2+的二价阳离子 酶切反应时酶浓度过低14关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当由作用于同一DNA序列的两种酶构成这一系统中的核酸酶都是类限制性内切核酸酶这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统15在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA互补链时应选用( )T4DNA聚合酶 Klenow酶大肠杆菌DNA聚合酶I T7DNA聚合酶16末端转移酶是合成酶类，( )作用时不需要模板在Ca2+的存在下，可以在突出的3，末端延长DNA链在Ca2+的存在下，可以在隐蔽的3，末端延长DNA链上述说法有两种是正确的17在基因工程中，可用碱性磷酸酶( )防止DNA的自身环化 同多核苷酸激酶一起进行DNA的5，末端标记制备突出的3，末端 上述说法都正确18下列酶中，除( )外都具有磷酸酶的活性核酸外切酶 外切酶 单核苷酸激酶 碱性磷酸酶19 下列哪一种酶作用时需要引物? ( )限制酶 末端转移酶 反转录酶 DNA连接酶20S1核酸酶的功能是( )切割双链的DNA 切割单链的RNA 切割发夹环 以上有两项是正确的21Klenow酶与DNA聚合酶相比，前者丧失了( )的活性。5，-3，合成酶， 3，-5，外切酶 5，-3，外切酶 转移酶22 下面关于松弛型质粒(relaxed plasmid)性质的描述中，( )是不正确的质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的制约，因而有较多的拷贝数可以在氯霉素作用下进行扩增 通常带有抗药性标记 同严紧型质粒融合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子 23 基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体中只有( )被视为用作基因工程载体的天然质粒载体pBR322 pSCl01 pUBll0 pUCl8 24 下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大?( )质粒 黏粒 酵母人工染色体(YAC) l噬菌体 cDNA表达载体 25. 松弛型质粒： ( ) 在寄主细胞中拷贝数较多 可用氯霉素扩增一般没有选择标记 上述、两项正确 26Col El是惟一用作基因工程载体的自然质粒，这种质粒： ( )是松弛复制型 （b)具有，四环素抗性 能被氯霉素扩增 能产生肠杆菌素27同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是：( )OCDNASCDNALDNA SCDNALDNAOCDNALDNAOCDNASCDNA SCDNAOCDNALDNA28pBR322是一种改造型的质粒，含有两个抗性基因，其中四环素抗性基因来自： ( )ColEl Ri质粒 pSCl01 pUCl829关于穿梭质粒载体，下面哪一种说法最正确?( )在不同的宿主中具有不同的复制机制在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率30能够用来克隆32kb以下大小的外源片段的质粒载体是( )charomid plasmid (C)cosmid phagemid31第一个作为重组DNA载体的质粒是( ) pBR322 ColEl pSCl01 pUCl832. Ti质粒：( )可从农杆菌转到植物细胞中 作为双链DNA被转移在植物中导致肿瘤 介导冠瘿碱的合成，作为细菌的营养物和植物的生长激素需要细菌的vir基因帮助转移 在植物细胞中作为染色体外质粒33黏粒(cosmid)是一种人工建造的载体，( )它具有COS位点，因而可进行体外包装 它具有质粒DNA的复制特性进入受体细胞后，可引起裂解反应 进入受体细胞后，可引起溶源化反应34有两种确定核酸中核苷酸序列的方法：化学序列分析法(Maxam-Glbert)和酶学序列分析法(Sanger)。酶学测序法的基本原理优点是：( )碱基与特殊染料间不同的相互作用一个合成引物的延伸和DNA修复合成的可靠终止限制性位点与DNA末端标记的相关性可同时对DNA双螺旋的两条链进行测序反应是DNA特异的，RNA不会带来干扰。这样既减少纯化步骤，也节约了开支。35关于cDNA的最正确的说法是：( )同mRNA互补的单链DNA 同mRNA互补的双链DNA以mRNA为模板合成的双链DNA 以上都正确36用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为：( )染色体DNA断成了碎片 染色体DNA分子量大，而不能释放染色体变性后来不及复性 染色体未同蛋白质分开而沉淀37. 关于碱解法分离质粒DNA，下面哪一种说法不正确?( )溶液I的作用是悬浮菌体 溶液的作用是使DNA变性溶液的作用是使DNA复性质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性38. Clark做了一个有趣的实验，发现TaqDNA聚合酶可以不需要模板，在双链DNA的末端加一个碱基，主要是加( ) dGTP dATP dCTP dTTP39根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。在下列文库中，( )属cDNA文库YAC文库 MAC文库 扣减文库 BAC文库40下面关于多克隆位点(multiple clone site,MCS)的描述，不正确的句是( )仅位于质粒载体中 具有多种酶的识别序列不同酶的识别序列可以有重叠 一般是人工合成后添加到载体中41在cDNA技术中，所形成的发夹环可用( )限制性内切核酸酶切除 用3外切核酸酶切除用S1核酸酶切除 用5外切核酸酶切除42在DNA的酶切反应系统中，通常：( )用SSC缓冲液 加入Mg2+作辅助因子加入BSA等保护剂 上述说法中，有两项是正确的43 黏性末端连接法，不仅操作方便，而且( )产生新切点 易于回收外源片段 载体不易环化 影响外源基因的表达44在下列表型中，( )是基因工程上理想的受体菌表型r+m+rec* r-m-rec- (C)r-m-rec+ r+m+rec-45关于DNA接头在基因工程中的作用，下列说法中哪一项不正确?( )给外源DNA添加适当的切点 人工构建载体调整外源基因的可读框 增加调控元件46cDNA文库包括该种生物的( )某些蛋白质的结构基因 所有蛋白质的结构基因所有结构基因 内含子和调控区47下列关于建立cDNA文库的叙述中，哪一项是错误的?( )从特定组织或细胞中提取DNA或RNA用反转录酶合成mRNA的对应单链DNA以新合成的单链DNA为模板合成双链DNA新合成的双链DNA甲基化 48下列对黏性末端连接法的评价中，哪一项是不正确的? ( )操作方便 易于回收片段易于定向重组 载体易于自身环化，降低重组率49关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确?( )(功具有可诱导性 具有可转移性细菌生长的任何时期都可以出现 不同细菌出现感受态的比例是不同的50下面关于用T4多核苷酸激酶标记5 端制备探针的描述中( )是不正确的。既能标记DNA，又能标记RNA 既能标记双链DNA又能标记单链DNA只能标记突出的5 端不能标记其他类型末端DNA或RNA必须有5-OH的存在51Southem印迹的DNA探针( )杂交。只与完全相同的片段 可与任何含有相同序列的DN*段可与任何含有互补序列的DN*段可与用某些限制性内切核酸酶切成的DN*段 以上都是52 用下列方法进行重组体的筛选，只有( )说明外源基因进行了表达。Southem印迹杂交 Northem印迹杂交Western印迹 原位菌落杂交53下列哪一个不是Southern印迹法的步骤?( )用限制酶消化DNA DNA与载体的连接用凝胶电泳分离DN*段 DN*段转移至硝酸纤维素膜上用一个标记的探针与膜杂交54 报告基因( ) 以其易于分析的编码序列代替感兴趣基因的编码序列以其易于分析的启动子区代替感兴趣基因的启动子区能用于检测启动子的活性 能用于确定启动子何时何处有活性55 在利用lacZ失活的显色反应筛选法中，IPTG的作用是( )诱导宿主的肽的合成 诱导宿主的肽的合成作为酶的作用底物 作为显色反应的指示剂56. 切口移位是指在( )作用下，使( )带上放射性标记。DNA聚合酶I，RNA DNA聚合酶I，DNADNA聚合酶，RNA DNA聚合酶，DNA57用于核酸分子杂交的探针可以是放射性标记的( )DNA RNA 抗体 抗原58Southern印迹是用DNA探针检测DN*段，而Northern印迹则是：( )用RNA探针检测DN*段 用RNA探针检测RN*段用DNA探针检测RN*段 用DNA探针检测蛋白质片段59用免疫化学法筛选重组体的原理是( )根据外源基因的表达 根据载体基因的表达根据mRNA同DNA的杂交 根据DNA同DNA的杂交60随机引物标记探针，下列各项中哪一项是不正确的?( )双链DNA、单链DNA、RNA都是可以标记的 不需要用Dnase I预处理反应时可用Klenow酶 反应时可用DNA聚合酶161在切口移位标记DNA探针时只能使用( )Klenow酶 DNA聚合酶I DNA聚合酶 DNA聚合酶62要对一双链的DNA分子进行3末端标记，可用( )Klenow酶 DNA聚合酶I T4DNA聚合酶 T7DNA聚合酶答案1c；2c； 3b； 4b 5b，C，d，e； 6c； 7b； 8d；9d； 10B； 11d； 12a； 13d； 14b 15d； 16c；17a，b；18a；19c；20d；21c；22C； 23b； 24C；25d；26a，C，d；27b；28c； 29b；30a；31c； 32a,c,d,e， 33a，b，c；34b； 35c；36c； 37d； 38b；39c；40a；41c； 42a，b，c； 43b； 44b； 45d； 46a；47a； 48c； 49c；50b；51c； 52c； 53b； 54a,c,d；55a； 56b；57a，b； 58c；59a；60d；61b； 62c；三名词解释1DNA recombination （标明中文名）2Restriction enzyme（标明中文名）3DNA 克隆4基因组文库5cDNA文库6Cloning vector（标明中文名）7转化（标明英文名）8感染（标明英文名）9转染（标明英文名）10In silico cloning（标明中文名）答案：1DNA重组：不同来源DNA分子通过共价连接（磷酸二酯键）而组合成新的DNA分子的过程。2限制性核酸内切酶：是能够识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性内切核酸酶识别DNA的结构顺序为回文结构。限制性内切核酸酶存在于细菌体内，限制外源DNA、保护自身DNA，对细菌遗传性状的稳定遗传具有重要意义。3就是应用酶学的方法，在体外把目的基因与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子一一复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。由于早期研究是从较大的染色体分离、扩增特异性基因，因此DNA克隆又称基因克隆。4分离组织或细胞染色体DNA，利用限制性内切核酸酶将染色体DNA切割成基因水平的许多片段，其中即含有我们感兴趣的基因片段。将它们与适当的克隆载体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组DNA分子内可能存在不同的染色体DN*段，这样生长的全部细菌所携带的各种染色体片段就代表了整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称基因组DNA文库(genome DNA library)。5 以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA (cDNA )，再复制成双链cDN*段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库(cDNA library)。与基因组DNA文库类似，由总mRNA制作的cDNA文库包含了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA。当前发现的大多数蛋白质的编码基因几乎都是这样分离的。6克隆载体：能将外源DN*段导入宿主细胞进行扩增或表达，并能在该宿主细胞内进行自我复制和表达的介质。7transformation：指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程。8infection：利用噬菌体将外源DNA导入宿主细胞的方法。9transfection：指真核细胞主动摄取或被动导入外源DN*段而获得新的表型的过程。常用的方法有电穿孔法，磷酸钙共沉淀法，脂质体融合法等。10电子克隆：通过基因数据库进行序列搜索，对比分析，拼接整合，预测新的假定的全长基因，然后通过分子生物学实验方法，加以证实，并从相应的组织，细胞中获得这种基因。四、简答题1说明Sanger DNA测序法的原理。2某学生在用EcoRI切割外源DN*段时，出现了星号活性，请分析可能的原因?3在序列5-CGAACATATGGAGT-3中含有一个6bp的类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么?4下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是类酶的识别序列：GAATCG，AAATTT， GATATC， ACGGCA? 为什么?5当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?为什么?6 为什么反转录酶在聚合反应中会出错?7 什么是测序酶(sequenaseTM)?8 什么是S1核酸酶作图(S1 nuclease mapping)? 9 YAC载体具有什么样的功能性DNA序列?为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性?10 列举质粒载体必须具备的4个基本特性。 11 什么叫穿梭载体？ 12 如何将野生型的l噬菌体改造成为一个理想的载体?13 PCR的基本原理是什么?用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息?14 cDNA克隆与基因组克隆有何不同?15 怎样将一个平末端DN*段插入到EcoR I限制位点中去?16 简述以黏粒为载体构建基因文库的原理。17 酵母人工染色体要在酵母细胞中稳定存在，必须有哪些基本的结构?18 何谓YAC? 主要特性是什么? 19 Muller的PCR反应同大肠杆菌体内的DNA复制有哪些不同?你认为根本的差别在哪里?20欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如Ecoli)中进行表达，克隆时应注意哪些问题?21假定你分离到一个Ecoli的Thy- 突变体，并推测有可能是ThyA基因突变。请设计一个方案用PCR从染色体DNA扩增突变的ThyA基因，测定突变的序列。(注：Ecoli野生型的ThyA基因的序列是已知的)22 你在做Southern印迹分析，并且刚完成了凝胶电泳这一步。根据方案，下面一步骤是用NaOH溶液浸泡凝胶，使DNA变性为单链。为了节省时间，你略过了这一步，直接将DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交，最后发现放射自显影片是空白。错在哪里?23切口移位(nick translation)标记探针的主要步骤有哪些?24用EcoRI和Hind 分别切割同一来源的染色体DNA，并进行克隆，在前者的克隆中筛选到A基因，但在后者的克隆中未筛选到A基因，请说明原因。25什么是Western印迹?它与Southern印迹有什么不同?26用一限制性内切核酸酶切割Lac+ Tet+的质粒载体，已知该酶识别的是4个碱基序列，并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在lac基因内有切割位点，并在第二个氨基酸密码子内，该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用 DNA聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环，转化Lac- Tets受体菌，筛选Tetr转化子，问：Lac的基因型是什么?并说明原因。27在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子?答案1 答：Sanger DNA测序法是建立在两个基本原理之上：(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由5端向3端聚合(DNA聚合酶参与了细菌修复DNA合成过程)；(2)可延伸的引物必须能提供游离的3羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3羟基末端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用4种双脱氧核苷酸终止反应，则会获得4组长度不同的DN*段。通过比较所有DN*段的长度可以得知核苷酸的序列。2 答：盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。3 答：回文序列是：5-CATATG-3，4 答：GATATC；AAATTT，因为它们是回文序列。5答：注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。6 答：由于反转录酶缺少在Ecoli DNA聚合酶中起校正作用的3-5外切核酸酶活性，所以聚合反应往往会出错，在高浓度的dNTP和Mg2+下，每500个碱基中可能有一个错配。7 答：所谓测序酶即是修饰了的T7 DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使T7 DNA聚合酶完全失去了3-5的外切核酸酶活性，只有5-3聚合酶的活性，而且聚合能力提高了39倍，测序时常用此酶。8 答：S1核酸酶作图是一种对RNA转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法。9. 答：YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。10答：(1)独立复制； (2)有选择标记； (3)有独特的酶切位点； (4)能转化但不扩散。11答：含有细菌质粒和克隆的真核生物DN*段的杂种质粒，有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭)。12. 答：(1)削减分子量(除去非必需区和整合区)； (2)削减酶切位点； (3)添加选择标记；(4)引入终止突变13答：(1)DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。(2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。14答：基因组克隆包含所有不在cDNA中出现的内含子。15答：化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DN*段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。16答：(1)COS位点可以自身环化； (2)可以利用COS位点包装l噬菌体颗粒；(3)可以感染寄主细胞； (4)利用质粒复制子复制，不整合、不裂解。17答：(1)着丝粒； (2)端粒； (3)ARS序列。18答：(1)含有来自其他生物DNA的酵母人工染色体，叫YAC；(2)主要特性是可以克隆较大的外源片段。19答：PCR用双引物，体内复制用单引物。20答：应注意的问题有：启动子、密码子、剪接、分泌。21答：为了扩增突变体的thyA基因，先设计一对引物，其中一个引物的序列与thyA基因的5端相同，另一个引物同该基因的3端互补。在引物的5端加上合适类限制性内切核酸酶的识别序列，以便于后来的克隆。将染色体DNA同引物混合后，进行PCR扩增。然后进行琼脂糖凝胶电泳，纯化扩增片段，可以直接测序或克隆到合适的载体再测序。22答：如果你的杂交探针是双链的，可能因为在加人杂交混合物之前忘记将探针变性而得到空白的放射自显影结果。23答：(1)DNaseI造成切口；(2)DNA聚合酶III的5 3外切核酸酶进行切割；(3)DNA聚合酶的53合成酶进行修补；(4)在修补过程中，随着切口(nick)的移动，将放射性的底物掺人到双链DNA中。24答：原因是：Hind的切点在A基因内。25答：Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。26答：基因型是lac-原因是在该密码子中插入了两个碱基，造成了移码突变，所以Lac的基因是缺陷的。27答：这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子之故。四、问答题：1 说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。2 什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素影向?3 影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些?4 什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?5细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途?6外切核酸酶(1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用?7Mn2+、Mg2+对Dnase I(deoxyribonuclease ?)的活性有什么影响?Dnase I在基因工程中有什么作用?8质粒如何维持在细胞中的稳定？9由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全，进行严格的监控，质粒载体的安全性是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几个方面?10为什么野生型的l噬菌体DNA不宜作为基因工程载体?11 什么是蓝白斑筛选法?12 蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性?13 M13系列载体具有哪些优缺点?14黏粒载体具有哪些特点与不足?15辅助噬菌体DNA和相应的噬菌粒是如何协同工作的?16 如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因?17 什么是基因文库?18 什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同?19 什么是cDNA文库(complementDNAlibrary)?同基因组文库有何差别?20 黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。21什么是同聚物加尾连接法(homopolymer tails joining)?用何种方法加尾?具有哪些优缺点?22何谓接头连接法(1inker ligation)?23什么是同裂酶?为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高?24为了大量获得许多用于生化鉴定的产物，你想将拟南芥中的一个序列已知、编码单体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达，你如何确保最终能得到产物?25某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因内有一Bgl I的切点。现用Bgl I切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体?26 以pBR322 DNA作为载体，从四环素抗性基因区克隆外源DNA时，可采用环丝氨酸富集法筛选重组体，说明其基本原理和基本操作过程。27 放射性抗体检测法(radioactive antibody test)的基本原理是什么?28 什么是随机引物(random primer)?如何标记DNA?29什么是印迹(blotting)杂交?30什么是原位菌落杂交(colony hybridization)?31说明Southern杂交的原理和方法。32Northern印迹与Southern印迹有什么不同?33建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆?答案：1 答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的各一个首字母，再加上序号。 基本原则： 3-4个字母组成，方式是：属名+种名+株名+序号； 首字母： 取属名的第一个字母，且斜体大写；第二字母： 取种名的第一个字母，斜体小写；第三字母： (1)取种名的第二个字母，斜体小写；(2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。第四字母： 若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，但用正体。 顺序号： 若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、 等，用正体。2 答：类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星活性。 概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(5, vv)；(2)限制性内切核酸酶用量过高(100UugDNA)；(3)低离子强度(25 mmolL)；(4)高pH(80以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。3 答：影响DNA连接酶催化连接反应的因素有很多，但温度对连接反应的影响较大。黏性末端链通常以12C一15C最好，这种温度有利于末端退火和连接酶的活性稳定。温度高了难以进行末端退火，低于上述温度会降低连接酶的活性。平末端连接以室温为宜，因为平末端连接不存在DNA的退火问题，但是温度高于30，连接酶特别不够稳定。平末端连接时连接酶的浓度要比黏性末端连接时高10-100倍。DNA中有残存的tRNA不会抑制DNA连接酶的活性，但是，如果NaCl的浓度高于150mmolL，则对连接反应有强的抑制作用。另外反应体系中有NH4+离子的存在，对Ecoli DNA连接酶具有激活作用。Ecoli DNA连接酶需要NAD+作辅助因子，而T4 DNA连接酶需要ATP。4 答：Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到两个片段，其中大片段的分子量为75kDa，它具有5-3聚合酶和3-5外切核酸酶的活性，小片段具有5-3外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中会降解5引物的5-3外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。Klenow酶主要有下列用途：(1)修复反应，制备平末端可用Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5或3突出末端，制备平末端，这