究磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶的研.pdf

第 2 4卷第 1期 2 0 0 8年 1月 参O O D M A C H I N E R Y 0 i Vo 1 24 No 1 J a n 2 0 0 8 本栏 目责任编辑 邹星 磁性 壳聚糖微球 固定化脂肪 酶的研 I n v e s t ig a t i o n o f immo b i l iz a t io n o f l ip a s e i n ma g n e t i c c h it o s a n 纵 伟 刘艳芳 赵光远 究 mi c r o s p h e r e s Z O NG W e i L I U Y a n f a n g Z H A O G u a n g y u a n 郑州轻工业学院食 品与生物工程学院 河南 郑 州4 5 0 0 0 2 S c h o o l o fF o o d a n d B i o l o g i c a l E n g i n e e r i n g Z h e n g z h o u U n i v e r s i t y ofL i g h t I ndu z t r y Z h e n g z h o u H e n a n 4 5 0 0 0 2 C h i n a 摘要 目的 制备具 有 高活性 的 固定化 脂肪酶 方 法 以磁性 壳聚糖微为载体 用物理吸 附法固定化脂肪酶 对影响 固定 化的各种因素进行考察 确定最优条件 并比较游离酶和固 定化酶 的 p H和 热稳 定性 研 究 固定化酶 的使 用 稳定 性 结 果 固定 化 的适 宜条件 为 采 用加 酶 量 6 0 0 U g 温度 5 p H 7 0 固定 时间 2 h 固定化酶 的 p H 和热稳 定性 都优 于游 离酶 固定化 酶 连 续使 用 5次 其 相 对 酶 活仍 为使 用 前 的 5 7 8 具有较好 的操作稳定性 结论 磁 性 壳聚糖微 球是 固 定脂肪酶 的良好载体 关键词 磁性壳聚糖微球 固定 脂肪酶 A b s t r a c t Ob j e c t i v e T o p r o d u c e i mm o b i l iz e d l i p a s e w i t h h i g h e r a c t i v i t y Me t h o d s L i p ase E C 3 1 1 3 w a s i mm o b i l i z e d i n ma g n e t i c c h i t o s a n mic r o s p h e r e s b y p h y s i c a l a d s o r p t i o n I n t h i s a r t i c l e d i ffe r e n t f a c t o r s i n flu e n c i n g t h e i mmo b i l i z a t i o n we r e i n v e s t i g a t e d a n d t h e o p t i mu m c o n d i t i o n s we r e a s c e r t a i n e d Co mp a r a t i v e s t u d i e s o f p H a n d t h e r ma l s t a b i l i t y b e t we e n f r e e l i p ase a n d i mmo b i l i z e d l i p a s e we re a l s o c o n d u c t e d Re s u l t s T h e o p t i mu m f a c t o r s o f i mmo b i l i z a t i o n we r e as f o l l o ws 6 0 0 U g l i p as e W as a d d e d t o t h e s o l u t i o n a t p H 7 0 5 0 Cf o r 2 h I n c o mp a r i s o n wi t h f r e e l i p a s e t h e pH a n d t h e rm a l s t ab i l i t y o f i mmo b i l i z e d l i p a s e we re i n c r e as e d u s e d i n h y d r o l y z a t i o n o f o i l t h e i mmo b i l i z e d e n z y me rema i n e d i t s a c t i v i t y o f 5 7 8 a f t e r 5 r e p e a t e d h y d r o l y z a t i o n Co n c l u s i o n Ma g n e t i c c h i t o s a n mi c ros p h e res Was a k i n d o f g o o d s u p p o rt for i mmo b i l i z e d e n z y me Ke y wo r d s Ma g n e t i c c h i t o s a n mic r o s p h e r e I mmo b i l i z a t i o n L i p a s e 脂 肪酶 E C 3 1 1 3 是一 类特殊 的酰基 水解 酶 脂 肪 酶能在 油一水界 面上催化酯水解 酯合成 酯交换 高 聚物合 成和立体异构拆分等有机合成反应 一 但游离酶催化 存 在 酶难 以分离 无法 重复利 用等 缺点 固定化脂 肪酶 不 仅 能保持酶催化高效和专一的特点 而且能大大提高酶的热稳 定性和化学稳定性 同时 易于分离 有利于酶的多次重复使 基金项 目 河南 省教 育厅杰 出科 研 人才 创新 工程 项 目 项 目编 号 2 0 07 KYCX0 0 2 0 作者简介 纵伟 1 9 6 5 一 男 郑州轻工业学院食品与生物工程学院 教授 博士 E m a i l z o n g w e i 1 9 6 5 1 2 6 c o rn 收稿 日期 2 0 0 7 1 0 2 6 用及产 品的纯化 然而 对于非磁性载体固定化酶的应用 存在着必须离 心操作 样品不得不稀释及载体回收损失大等问题 因此 寻 求更好的固定化酶 载体成 了人们 研究 的热点 用 磁性 高分 子作为酶的固定化载体即可有效地避免以上问题 它可借助 外部磁场 简单 方便地回收和磁性导向 近年来磁性高分 子载体固定脲酶 糖化酶等的研究已有报道 J 而采用磁性 壳 聚糖微 球固定脂 肪酶 还少有报道 本研究以磁性壳聚糖为载体 采用物理吸附法固定脂肪 酶 探讨 固定化 的工艺条件 并对 固定化 酶的性质进行研究 l 试验材料与方法 1 1 材料与仪器 壳 聚糖 浙江玉环生物制品公司 脱 乙酰度 8 5 脂肪酶 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 2 5 戊二醛 中国医药集 团上海化学试剂公 司 其他试剂 均为分析纯 数控恒温水浴锅 常州国华 仪器有 限公 司 p H计 上 海第 二分 析仪 器厂 7 5 1 一 G D紫外可见光分光光度计 上 海分析仪器总厂 1 2 试验 方法 1 2 1 磁性 壳 聚糖 微球 的制 备 将 4 0 0 mL的 F e C 1 0 1 2 3 m o l L 一 F e c l 0 1 0 3 m o l L 混 和 液 与 5 m o l L的 N a O H溶液 1 6 0 m L混合 剧烈搅拌 1 0 m i n 得到磁流体 将 2 mL 磁流体 4 壳 聚糖 乙酸溶 液 3 乙酸溶 液配 制 2 0 mL 8 0 mL液体 石蜡 5 mL s p a n 一 8 0加 入 2 0 0 m L锥 形 瓶 中 于4 0 下充分搅拌 1 5 m i n 然后加 入 4 m L 1 8 5 戊 二 醛 调 p H至 9 0 反应 2 h 分别 用异丙醇 乙醚 丙酮 和水充 分洗涤后 冻干 用磁铁将产物分离 得磁性壳聚糖微球 1 2 2 磁性壳聚糖微球固定化酶的制备将磁性壳聚糖微 球加入 1 0 0 mL锥形 瓶 中 用磷 酸缓 冲液 充分溶涨 取 出 同 时将脂肪酶溶于p H 7 0的磷酸缓冲液 1 0 0 mL 然后将溶涨 3 维普资讯 科研开发 2 0 0 8年第 1期 的磁性壳聚糖微球加入脂肪酶磷酸缓冲溶液中 恒温摇床振 荡一定时间 用磁铁将磁性壳聚糖微球沉淀 倾出上清液 用 磷酸缓冲液洗至洗出液无紫外吸收 得固定化酶 1 2 3 酶活的测定采用橄榄油乳化法测定脂肪酶的活 性 脂肪酶的活力定义 1 mi n内催化脂 肪水解 生成 1 胂o l 脂肪酸所需的酶量定义为 1单位酶活力 1 2 4 固定化酶的活力回收率 活力回收率 丽 x 1 0 0 2 结果与讨论 2 1 固定化反应条件的确定 分别研究不同酶量 固定温度 固定 p H和固定时间对固 定化酶的活力回收率的影响 结果见图 1 4 辫 回 呈 加酶 量 U g 温度 5 p H 7 0 时间 2 h 图 l 加酶量对活性回收率的影响 F i g u r e l E ff e c t o f l i p a s e d o s a g e o n a c t i v i t y r e c o v e r y 5 0 4 0 褂3 O 罂2 0 嫂 l O O 5 l O l 5 2 O 2 5 3 0 温 度 加酶量 6 0 0 u 幢 p H 7 0 时间 2 h 图2 温度对活性回收率的影响 Fi g u r e 2 Effe c t o f t e mp e r at u r e o n a c t i v i t y r e c o v e r y 由图 l 4可见 加酶量小于6 O O U g 时 随着加酶量增 加 固定化酶的活力回收率增加 但大于6 0 0 U g后 固定化 酶的活力回收率增加缓慢 温度越低 固定化酶的活力回收 率越低 p H 7 0时 固定化酶的活力回收率最大 过酸过碱条 件下 固定化酶的活力回收率都减少 在 2 h以内 时间增 加 固定化酶的活力回收率增加 但大于2 h后 固定化酶的 活力回收率增加缓慢 综合以上因素 固定化酶的条件采用加酶量 6 0 0 U g 温 度 5 oC p H 7 0 固定时间 2 h 4 5 0 4 0 槲 3 O 罢2 0 们 l O 褂 回 呈 5 时 I可 h 加 酶量 6 0 0U g 温 度 5 o C p H 7 0 图4 时间对活性 回收率的影响 Fi g ur e 4 Ef f e c t o f t i me O il a c t i v i t y r e c o v e r y 2 2 固定化酶性质的研究 2 2 1 固定化酶的热稳 定性将 固定酶和游离酶在 p H 7 0 条件下 置于不同的温度中 3 0 mi n后分别取固定酶和游离 酶测定其活力 图 5 固定化酶的热稳定性明显高于游离 酶 在 4 o 处理 3 0 m i n后 固定化酶仍 保持 5 4 4 的酶 活 而这时游离酶活只有 3 2 9 可见固定酶具有更好的热 稳定性 这可能是 因为固定化后酶分 子之间 以及酶 与载体 分子之间的相互作 用使得酶分子结构 刚性 增强 因而抗拒 热 变性作用能力增加所致 游 离酶 由于缺乏 这些作用 力 较 容 易因为去折叠而变性 1 0 时间 h 图 5 固定化酶的热稳 定性 F i gu r e 5 Th e r ma l s t a bi l i t y o f i mmo bi l i z a t i on l i p a s e 加 O 窑 娌靛孵 维普资讯 第 2 4卷第 1 期 纵伟等 磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶的研究 2 2 2 固定化 酶的 p H稳定性将固定酶和游离酶在 2 0 条件下 置于不同p H条件下 3 0 mi n后分别取固定酶和游离 酶测定其活力 图6 固定化酶的p H稳定性明显高于游离 酶 这是因为在固定化过程中 吸附或交联使酶分子产生多 位 点固定化 与游离酶相 比 固定化 酶分 子 的构象更 加稳定 对 酸碱 的耐受性更强 娌 蠢 6 7 8 9 p H 图 6 固定化酶的热稳定性 Fi g ur e 6 pH s t a b i l i t y o f i mmo bi l i z a t i o n l i p a s e 2 2 3 固定化酶 的操作稳定性将 固定化酶 重复用于橄榄 油乳化液 的水解反应 观察酶活变化 结果见 图 7 当固定化 酶重复使用 5次后 其相对酶活仍为未使用时的 5 7 8 表 明固定化酶 的操作稳定性较好 娌 嚣 2 4 6 8 使用 次数 次 图7 固定化酶 的操作稳 定性 F i g u r e 7 Op e r a t i n g s t a b i l i t y o f i mmo b i l i z a t i o n l i pa s e 3 结论 吴茜茜等 研究 了壳 聚糖 吸附和戊二 醛交联对 脂肪 酶 固定化条件 经固定后 酶活力回收率约为 5 4 2 经过 1 0 批次连续 水解植物油反应 固定化酶 的活力保 持在 8 2 6 陈秀琳 采用 C M 纤维素固定化脂 肪酶 经 固定 后 酶活力 回收率最高为 4 1 8 经水 解橄榄 油重复 试验发 现 其半衰 期为2 2 5 h 本试验以磁性壳聚糖微球为载体 采用吸附法 固定化的脂肪酶 酶 活力 回收率 最高为 4 3 6 重复用 于橄 榄油乳化液的水解反应 5次后 其相对酶活仍为未使用时的 5 7 8 表明其活力 回收率和使用稳定性于以上方法相当 但该法固定的脂肪酶 使用磁场回收 回收更方便 以磁性壳聚糖微球为载体 采用吸附法固定化脂肪酶 固定化酶 的条件为 加 酶量 6 O O U g 温度 5 p H 7 0 固定 时间 2 h 同游离酶相 比 固定化 脂肪酶 p H稳 定性 热稳 定 性均高于游离酶 表明磁性壳 聚糖微球是固定脂肪酶的良 好载体 参考文献 l 周健 倪婉星 张晓鸣 非水相脂肪酶催 化体 系分子筛脱水机 制的 研究 J 食 品与机 械 2 0 0 5 2 1 2 7 7 7 9 Z h o u J i a n L i Wa n x i n Z h a n g Xi a o mi n g S t u d y o n t h e d e h y d r a t i o n me c h a ni s m o f mo l e c u l a r s i e v e f o r l i p a s e c a t a l y z e d r e a c t i o n s y s t e ms i n o r g ani c s o l v e n t J F o o d and Ma c h i n e r y 2 0 0 5 2 1 2 7 7 7 9 2 S i fir u n g W Ar a n H K Uwe T e t a1 1 i p a s e c a t a l y z ed s y n t h e s i s o f s t r u c t u r e d t r i a c y l g l y c e fi d e s f r o m l 3 D i a c y l g l y c e fi d e s J J a o c s 2 0 0 4 8 1 2 1 5 l 1 5 5 3 W o n g s a k u l S P r a s e s a n P Bo m s c h e u e r U T e t a1 S y n t h e s i s o f 2 Mo n o g l y c e r i d e s b y alc o h o l y s i s o f p alm o il a n d t u n a o i l u s i n g i mmo b i l i z ed l i p a s e s J E u r J L i p i d S c i T e c h n o l 2 0 0 3 1 0 5 6 8 7 3 4 杨本宏 蔡敬 民 吴 克 等 海藻 酸钠固定化根霉脂肪 酶的制 备及 其性质 J 催化学报 2 0 0 5 2 6 1 1 9 7 7 9 8 1 Yang Be n h o n g C a i J i n g mi n Wu Ke e t a1 Pr e p a r a t i o n and p r o p e r t i e s o f s o d i u m al g i n a t e i mm o b i l iz ed r h i z o p u s d e l e m ar l i p a s e J C h i n e s ej o u mal o f c a t al y s i s 2 0 0 5 2 6 1 1 9 7 7 9 8 1 5 任广智 李振华 磁性壳聚糖微球用 于酶的 固定化研 究 J 离 子 交换与吸附 2 0 0 1 1 7 2 1 5 2 1 5 8 Re n Gu an g z h i Li Z h e n h u a T h e i mmo b i l i z a t i o n o f u rea s e o n t o ma g n e t i c c h i t o s a n m i c r o s p h e re J I o n E x c h ang e a n d A d s o r p t i o n 2 0 0 1 1 7 2 1 5 2 1 5 8 6 Ba h ar T Ce l e b i S S Ch ara c t e ri z a t i o n o f g l u c o a my l a s e i mmo b il i z ed o n m a g n e t i c p o l y s t y r e n e p a r t i c l e s J E n z y me and Mi c r o b i al T e c h n o l o g y 1 9 9 8 2 3 3 0 1 3 04 7 De n k b a s E B Ki l i c a y E B i r l i k e s e v e n C e t a1 Ma g n e t i c c h i t o s a n m i c r o s p h e re p r e p a p a t i o n a n d c h ara c t e r i z a t i o n J R e a c t i v e F u n c t i o n al P o l y m e r s 2 0 0 2 5 0 2 2 5 2 3 2 8 王斌 谢苗 曾竞华 等 磁性壳 聚糖 微球 固定化褐藻酸 酶的研究 J 中国水产科学 2 0 0 4 l l 3 2 5 3 2 5 7 Wa n g Bi n Xi e Mi a o Zh e n J i n h u a e t a1 S t u d y o f i mmo b i l i z a t i o n o f alg i n a t e l y a s e o n c r o s s l i n k ed m a gne t i c c h i