实时荧光定量PCR讲座.ppt

实时荧光定量PCR 一 概念二 前期问题三 准备问题四 反应中问题五 反应后数据分析六 结果问题七 特殊问题八 恐怖问题九 注意事项END 信息交流 概念 谁会用到RealtimeqPCR 基本原理是什么 谁会用到RealtimeqPCR 精确的DNA定量微生物检测 病毒拷贝数转基因检测 转基因拷贝数相对的DNA定量 差异 基因表达差异 基本原理 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化 最终精确地对起始模板定量分析阈值 Xn 荧光扩增曲线指数扩增期的荧光强度标准 PCR扩增产物量的标准 C t 值 n 荧光信号 扩增产物 到达阈值时所经过的扩增循环次数 浓度的对数值与循环数呈线性关系 根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量 标准曲线 通过浓度梯度标准品 绘制标准曲线样品结果与标准曲线比对得到精确的C t 值 浓度 绝对定量 敏感性高 检测低拷贝数样品 区分小差异样品大范围拷贝数样品同时检测 100 1010省时有效临床检测 转基因检测 环境监测等 设置内标 b actin GAPDH等管家基因对靶基因进行均一化 靶基因拷贝 每一个内标基因拷贝双标准曲线法含靶基因与含内标基因的浓度梯度质粒分别做标准曲线 样本靶基因与内标基因绝对浓度的换算 并均一化处理 标本间靶基因的表达水平分析2 c t 法标本内靶基因与内标基因Ct值比较 C t C t m C t n标本间 C t 比较 c t C t 1 C t 22 c t 计算 相对定量 常用荧光检测方法SYBR非特异性TaqMan特异性与扩增的片断配对 前期问题 荧光定量要多少钱 我应该选用那种荧光标记方法 荧光定量要多少钱 SYBR方法 PCR反应体系 SYBR染料 管子 0 5 0 02 0 6 1 0 1 5元TaqMan方法 PCR反应体系 探针 管子 0 5 1 5 0 6 3 0元 Northern标记试剂盒 膜 同位素 时间 10元 我应该选用那种荧光标记方法 医疗检验TaqMan探针法特异准确科研SYBR方法便宜方便TaqMan探针法要求严格的相对定量 准备问题 双标准曲线法还是 Ct法 怎么作标准品 荧光定量PCR的反应体系特殊吗 什么酶可以做 双标准曲线法还是 Ct法 相对定量方法基因表达差异目标基因 内标基因 Ct只依靠Ct值用于大通量 很多基因 如芯片结果 计算简单估计性的结果要求目标基因和内标基因扩增效率都比较好 双标准曲线法还是 Ct法 双标准曲线法结果精确对扩增效率要求不高构建目标基因与内标基因的标准品相当于两个绝对定量每次反应都要作标准曲线 用什么作为内标基因 内标基因的目的 用来均一化目标基因 即保证目标基因的比较在一条水平线上最常用的内标基因 actin GAPDH选用的18S表达恒定并不被处理影响的基因容易扩增 如何制作标准品 荧光定量标准品主要用于绝对拷贝数定量包含扩增片断的质粒 或者基因组DNA步骤用设计的引物从待检测样品中扩增产物片断纯化后装入T Easy载体 测序从菌中提取并纯化质粒 用分光光度计定量 ug ul 如何制作标准品 以Adeasy腺病毒质粒为例 一个质粒MW 36820bpX2X330 2 43x1072 43x107g6 023x1023个分子 4 03x10 17g 一个质粒 1copy 的质量 计算出拷贝数 copies ul 梯度稀释制作标准品 大体积稀释10ulto90ul 定量PCR 检查Ct值差异产物跑胶鉴定大小 qPCR的反应体系特殊吗 什么酶可以做 类似于普通PCRSYBR 抑制问题TaqMan 探针的退火普通的Taq酶都可以胜任TaqMan 5 外切酶活性反应体系的调节Mg2 DMSO PCR反应体系SYBRI 25 l 10 PCRBuffer2 5 ldNTPmix2 lI20 l Taq0 25 lPremix10 lPrimersFinal0 2 MPrimers0 4eachSYBRI0 25 0 5 SYBRI0 25 0 5 反应程序的建立 按照常规PCR方法配制反应体系 并加入SYBR染料程序1 95 5min2 95 20sec3 58 20sec4 72 20sec5 ReadPlate6 Goto2repeat397 72 5min8 Meltingcurveanalysis9 End 收集荧光信号查看产物的特异性 按照常规PCR方法配制反应体系 并加入TaqManProbe程序1 95 5min2 95 10sec3 60 40sec4 ReadPlate5 Goto2repeat396 End 收集荧光信号 反应中问题 熔解曲线有什么用 只作一次标准曲线可以吗 熔解曲线有什么用 SYBRI逐步提高温度 读取荧光值 得到温度与荧光值的关系曲线目的 1 决定产物双链的解链温度2 产物的特异性 PCR反应的好坏 设定适合的读板温度 避免非特异性产物的荧光信号干扰 熔解曲线有什么用 程序优化 1 95 5min2 95 20sec3 60 20sec4 72 20sec5 ReadPlate6 85 1sec7 ReadPlate8 Goto2repeat399 72 5min10 Meltingcurveanalysis11 End 熔解曲线有什么用 无法知道产物的大小Tm值较大的非特异性产物 与产物峰重叠 无法用该方法区分 只作一次标准曲线可以吗 不行 荧光定量PCR标准曲线不同于普通的标准曲线 更加敏感扣除背景 空白域值线的设定 一个样品需要多少重复 重复的目的 实验结果的可靠性 平均值 不是加样的能力 2个重复3个重复完全重复倍数重复 1 2 4倍样品 Ct值差异 1 可以接受 样品数量过多 怎么办 双标准曲线法每次都构建对应标准曲线任意分割样品的组合 Ct法目标和内标基因不能分开扩增样品数量过多时 每次扩增时必须加入标志样品 作图中被考虑为1倍的样品 反应后数据分析 反应后做的第一件事怎么设置域值曲线 反应完成后第一件事 进入原始的扩增曲线图 评价反应情况 反应完成后第一件事 真实RawData处理的结果 反应完成后第一件事 扩增与无扩增糟糕的扩增 反应完成后第一件事 重复 熔解曲线的暗示 产物特异性读板温度 熔解曲线的暗示 反映本质问题 域值线的设置 曲线的优化扣去基线 Baseline CycleRange 此区域内的荧光信号为背景 MinimumovercyclerangeAverageovercyclerangeMinimumGlobal扣去空白 Blank 没有污染 导致平台期下降 域值线的设置 背景 Background 空白 Blank 相关系数 r2 指数扩增区 Log 域值线的设置 自动设置选择CycleRangeCycleRange中荧光 曲线优化后 的标准差的10倍 作为域值 经验公式 域值线的设置 手动设置 Manual 高于背景值高于空白 无污染 相关系数逼近1Log曲线的线性区的最小域值 结果问题 扩增效率是怎么回事 标准曲线怎么了 扩增效率是怎么回事 标准曲线y Ax B A lg 1 Ex 3 01相当于扩增效率 100 一般都大于这个值扩增曲线在Ct值处的扩增效率PFAFFLMethod 标准曲线怎么了 相关系数差小于0 9源于标准品的浓度不准确 稀释问题 源于加样不准确 标准曲线怎么了 梯度稀释不梯度Ct值较大时 检查扩增的是否是目的产物Ct值较小时 检查水是否被污染 Ct值在多少时是可信的 临床检验小于33相当于104 103科学研究小于38相当于102 101特殊应用除外 特殊问题 普通PCR可以 但是荧光定量PCR作不出来怎么办 普通PCR可以 但是荧光定量PCR作不出来怎么办 到目前为止最为头痛的问题一般出现在SYBRI为染料的实验中考虑方向反应条件 普通PCR不等于荧光定量PCR Mg离子 DMSO 酶 煺火温度SYBRI的抑制TaqMan荧光定量的专用管子密封差 恐怖问题 污染 敏感VS污染主要污染源质粒标准品PCR反应产物 污染问题 试剂mixer尽量分装 不要原瓶多次取用引物与探针稀释到一定浓度后分装 保证有备份 以防一管污染之后全军覆没水需要使用最好质量的去离子水 可以从试剂公司购买专用水 污染问题 加样原则是DNA最后加有条件的话在生物安全柜里面加样 可防止空气中杂质的污染产物安全的处理扩增产物 污染问题 如果发生了排查问题更换试剂与耗材 甚至全换 清洁环境 甚至换地方 改变实验设计 换一段扩增片断坚持 注意事项 使用前后请进行使用登记 注意是否有人预约 开机后启动软件的几分钟内不要打开机器盖子 否则会造成不联机 不能完成反应 PCR仪运行时 可以另外再双击 OpticonMonitor3 软件打开一个窗口进行其他操作 但是务必不能关闭正在运行的窗口 如果要卸除U盘 小心不要把同时联机的PCR仪卸除 不要用此PCR仪进行非荧光PC