134-我国部分地区自然发酵豆酱中的曲霉菌及其有性型(.doc

Vol.27 No.3 343我国部分地区自然发酵豆酱中的曲霉菌及其有性型*Corresponding author. E-mail: 收稿日期：2007-09-18，接受日期：2007-10-31陈嵘1,2 吕国忠2* 刘志恒11沈阳农业大学植物保护学院 沈阳 1101612大连民族学院生物资源与环境研究所 大连 116600摘 要：从我国42个地区的自然发酵酱醅和酱醪样品中分离得到曲霉Aspergillus及其有性型真菌20种，其中优势曲霉菌种类为A. tubingensis、A. flavus、A. niger、A. ochraceus、A. candidus和A. fumigatus。调查研究发现，从酱醅和酱醪样品中分离出黄曲霉的频率较高，表明自然发酵豆酱存在一定的安全隐患。研究中分离获得的曲霉菌株有望用于纯种制曲或特殊风味豆酱的工业化生产。关键词：发酵食品，真菌分类，菌落，培养Aspergillus species and their teleomorphs isolated from naturally fermented soybean pastes in some regions of ChinaCHEN Rong1, 2 LV Guo-Zhong2* LIU Zhi-Heng11College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China2Institute of Bio-Resources and Environment, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, ChinaAbstract: Twenty species of Aspergillus and their teleomorphs were isolated from naturally fermented soybean pastes collected in 42 regions of China. Of which A. tubingensis, A. flavus, A. niger, A. ochraceus, A. candidus and A. fumigatus were predominant. The high frequency of A. flavus from the samples indicates that the traditional making method of soybean paste might possibly be harmful to food safety. Some Aspergillus species or strains isolated from the traditional food samples may be hopeful of using in pure leaven making and industrial production of soybean paste with special flavor. Key words: fermented food, fungal taxonomy, colony, culture曲霉菌Aspergillus spp.是自然界中分布最为普遍的真菌类群之一，其中许多种类具有重要的经济价值，与人类的关系极为密切。曲霉用于东方传统酿造业的历史非常悠久，我国以及东南亚地区的酿酒、制酱、酱油、豆豉和味噌等主要是利用曲霉菌发酵（齐祖同 1997）。齐民要术“作酱法”中记载，制酱要先“发黄子”（即在物料表面形成黄衣），古人了解“黄衣”在制酱中的重要性，而且懂得如何掌握季节变化来利用这种野生黄色霉菌进行发酵（陈宪仪 1998）。现在看来，这种黄色霉菌就是米曲霉A. oryzae。自然发酵的豆酱风味独特，营养丰富，是日常饮食中的佐餐佳品。在我国的辽宁、吉林、黑龙江、内蒙古、北京、河南、河北、陕西、浙江、江苏、贵州、四川、福建、江西、广东等地，民间自然发酵豆酱非常普遍，只是名称、制作方法各有差异，有的还在豆酱中加入各种时令蔬菜或肉类，成为当地特色风味酱。自然发酵豆酱之所以风味独特，魅力经久不衰，与发酵过程中多种微生物的共同作用具有非常密切的关系。然而，自然发酵豆酱生产周期长，质量不稳定，在完全开放式的制作过程中，空气中大量的微生物自由落入，若气候异常，管理不善，极易发生食品安全隐患。许多国家和地区都有当地特色的传统发酵食品，为了提高发酵水平，确保食品安全卫生，各国都在努力应用现代生物技术选育优良菌株进行纯种发酵（路秀玲和欧宏宇 2000）。我国的酱油、腐乳生产也已基本实现工业化，而对豆酱的研究相对较少，当前的生产模式还是以家庭作坊式为主（牛天娇和马莺 2005）。因此，研究自然发酵豆酱中的菌系，筛选出用于工厂化纯种制曲的优良菌株具有非常重要的现实意义。本文从辽宁、吉林、黑龙江、内蒙古等42个地区自然发酵的家庭自制豆酱样品中分离到20种曲霉及其有性型真菌，主要采用传统形态学方法进行了系统的分类学研究，为豆酱发酵生产提供菌种保障。1 材料与方法1.1 样品在黑龙江省（伊春、佳木斯、齐齐哈尔、绥化、大庆、哈尔滨、牡丹江、延寿）、吉林省（延吉、吉林、长春、四平）、辽宁省（铁岭、沈阳、台安、盘山、辽阳、海城、阜新、义县、朝阳、葫芦岛、庄河）、内蒙古自治区（赤峰和通辽）、河南、河北、四川、安徽、贵州、福建、江西等42个地区采集到170余份自然发酵的豆酱样品。同时采集长春市双阳区昌隆酿造厂、大连市黑土地酿造厂纯种发酵生产的豆酱进行对比试验。样品包括豆酱的制曲阶段（酱醅）和盐水发酵及成熟阶段（酱醪）。将酱醅样品装于洁净的采样袋中，酱醪样品装入灭菌的医用小瓶，带回实验室用于真菌分离和培养。1.2 真菌的分离培养在无菌条件下称取2.5g样品放入盛有25mL无菌水的灭菌三角瓶中，置于振荡器上振荡3h，用无菌水以1:10的稀释度递增稀释，选择3个合适的稀释度，采用孟加拉红、查氏琼脂和高盐麦芽汁琼脂三种培养基作倾注培养，置于25恒温箱中培养5d后观察菌落，并计数，在7-10d复检，并对培养基上长出的菌落进行纯化培养。1.3 曲霉菌的形态学鉴定曲霉菌形态学鉴定采用查氏培养基Czapek Agar（CA）、查氏酵母浸出液培养基Czapek Yeast Extract Agar（CYA）（25、37）、麦芽汁培养基Malt Extract Agar（MEA）和查氏酵母浸出液加蔗糖培养基Czapek Yeast Extract Agar with 20% Sucrose（CY20S）（Klich 2002）。7d观察记录培养性状和显微特征，并进行显微照相，对于有性型则培养10-14d或更长时间。无特殊说明培养条件均为25。2 结果与分析共分离到真菌80余种，其中曲霉（包括有性型）为优势类群，共20种，结果如下：泡盛曲霉Aspergillus awamori Nakaz., Rept. Inst. Govt. Res. Formosa No 1, 1907 & No 4, 1915菌株：IBE 07041402。菌种来源：赤峰。亮白曲霉 Aspergillus candidus Link: Fr., Mag. Ges. Naturf. Freunds Berlin 3: 16, 1809菌株：IBE 04050602，IBE 05051803，IBE 07061105。菌种来源：牡丹江、吉林、庄河。矮棒曲霉 Aspergillus clavatonanicus Bat. et al., Anais Fac. Med. Univ. Recife 15: 197, 1955菌株：IBE 07061101。菌种来源：庄河。棒曲霉 Aspergillus clavatus Desm., Ann. Sci. Nat., Ser. 2. 2: 71, 1834菌株：IBE 05051802，IBE 06042805。菌种来源：吉林、庄河。黄曲霉 Aspergillus flavus Link: Fr., Mag. Ges. Naturf. Freunde Berlin 3: 16, 1809菌株：IBE 04033102，IBE 04041811，IBE 04041701，IBE 05051801，IBE 05051902，IBE 05052104，IBE 05051302，IBE 07030603，IBE 07030604，IBE 07061104，IBE 07060601。菌种来源：沈阳、昌图、铁岭、吉林、延吉、长春市昌隆酿造厂、大庆、哈尔滨、庄河。烟曲霉 Aspergillus fumigatus Fres., Beitr. Mykol. p. 81, 1863菌株：IBE 04030501，IBE 04033101，IBE 07022802。菌种来源：伊春、沈阳、河北。日本曲霉 Aspergillus japonicus Saito, Bot. Mag. Tokyo 20: 61, 1906菌株：IBE 07052502。菌种来源：大连市黑土地酵造厂。黑曲霉 Aspergillus niger v. Tiegh., Ann. Sci. Nat. Bot. Ser. 5. 8: 240, 1867菌株：IBE 04030501，IBE 05052101，IBE 05051302，IBE 07030201，IBE 07030102，IBE 07030603，IBE 07020301。菌种来源：伊春、长春市昌隆酿造厂、大庆、赤峰、哈尔滨、辽阳。赭曲霉 Aspergillus ochraceus Wilh., Beitrge zur Kenntniss der Pilzgattung Aspergillus. Diss. Strassburg p. 66, 1877菌株：IBE 04041701，IBE 05051105，IBE 05051304，IBE 06021802。菌种来源：铁岭、佳木斯、大庆、绥化。米曲霉 Aspergillus oryzae (Ahlb.) Cohn, in Jabresb. Schles. Ges. Vaterl. Kult. 61: 226, 1884 菌株：IBE 07051501，IBE 07052502，IBE 07060204。菌种来源：大连市黑土地酵造厂。聚多曲霉 Aspergillus sydowii (Bain. & Sart.) Thom & Church, The Aspergillus, p. 147, 1926 菌株：IBE 06020801，IBE 06121701。菌种来源：四川、福建。溜曲霉 Aspergillus tamarii Kita, Zentr. Bakteriol. Parasitenk. Abt. II. 37: 433, 1913菌株：IBE 07022801。菌种来源：安徽。土曲霉 Aspergillus terreus Thom, in Thom & Church, Am. J. Bot. 5: 85, 1918菌株：IBE 05051703，IBE 06042805。菌种来源：哈尔滨、庄河。塔宾曲霉 Aspergillus tubingensis Moss., La Cellue 43: 245, 1934菌株：IBE 04033102，IBE 04050604，IBE 05041504，IBE 05041303，IBE 05051703，IBE 05051706，IBE 05052401，IBE 05051801，IBE 05051803，IBE 05051902，IBE 05051904， IBE 05052101，IBE 05052105，IBE 05051501，IBE 05051504，IBE 05051104。菌种来源：沈阳、牡丹江、阜新、台安、哈尔滨、海城、吉林、延吉、长春市昌隆酿造厂、齐齐哈尔、佳木斯。焦曲霉 Aspergillus ustus (Bain.) Thom & Church, The Aspergilli, p. 152, 1926菌株：IBE 05041303。菌种来源：义县。杂色曲霉 Aspergillus versicolor (Vuill.) Tirab., Ann. Bot., Roma 7: 9, 1908菌株：IBE 04033101，IBE 05052105。菌种来源：沈阳、长春市昌隆酿造厂。蜡叶散囊菌 Eurotium herbariorum (Wiggers: Fr.) Link, Mag. Ges. Naturf. Freunde, Berlin 3: 31, 1809菌株：IBE 06111402。菌种来源：江西。赤散囊菌 Eurotium rubrum Knig et al., Zeit. Untersuch. Nahr. u. Genussm. 4: 726, 1901菌株：IBE 06060601。菌种来源：庄河。高渗散囊菌 Eurotium tonophilum Ohts., Bot. Mag. Tokyo 75: 438, 1962菌株：IBE 07030101，IBE 06111401。菌种来源：通辽、江西。曲霉未定种Aspergillus sp.根据菌落特征和显微形态特征，该菌株属于黑色组Sect. Nigri。该菌株的最显著特征是孢梗茎上着生不规则的小副枝，这一特征为曲霉菌的首次描述。该菌株分生孢子的特征（大小、粗糙程度）和孢梗茎长短与黑色组的其它种不完全符合，其分类地位有待于进一步研究。菌株：IBE 07051501。菌种来源：大连市黑土地酿造厂。3 讨论本研究共分离到20种曲霉及其有性型真菌，其中的优势种为A. tubingensis、A. flavus、A. niger、A. ochraceus、A. candidus和A. fumigatus。这几种曲霉分布广泛，在各地酱醅和酱醪样品中均可分离得到。这些曲霉菌可以产生真菌毒素或引起人和动物的曲霉病aspergillosis（齐祖同 1997），因此，从食用角度和环境卫生方面来看，家庭自制豆酱对人体健康都存在着安全隐患。本研究未能从家庭自制豆酱样品中分离到米曲霉，可见开放式的制作环境不利于这种有益真菌的生长。长春市昌隆酿造厂为根霉菌纯种制曲，发酵过程的各个阶段并无黄曲霉的污染，然而，本研究从一胀袋成品中分离到了黄曲霉菌株，说明豆酱的成品再发酵具有潜在危害。其余的曲霉种类分离频率较低，仅在某一地区中分离得到。研究发现耐高渗透压的曲霉有性型只出现于酱醪样品中，这些种类可能在豆酱后期发酵中发挥作用。自然发酵豆酱中蕴藏着丰富的真菌资源，国外未见有专门对豆酱中真菌的报导，但对一些相类似的传统发酵食品微生物种类有过报导。Lotong（1978）认为，在东南亚自然接种的酱油曲中的相关微生物主要是黄曲霉群 A. flavus group、根霉 Rhizopus、毛霉 Mucor、共头霉 Syncephalastrum 以及结合酵母属 Zygosaccharomyces；Bhumiratana et al.（1980）从泰国自然发酵的酱油曲中分离到黄曲霉柱头变种 A. flavus var. columnaris，并认为该菌株不产毒素，其发酵能力优于通常使用的A. oryzae菌株。Wood（2001）总结了食品中分离到的大多数曲霉菌为米曲霉；国内冀鹤鸣（1948）和刘守初（1950）分别报导了我国西北和北京地区酱曲中的曲霉，测定发酵曲霉的糖化能力和蛋白质分解能力，以选取更为优良的菌种；张国柱等（1986）从北京地区两户农家自制豆酱中分离出10余种曲霉；贡汉坤和姚清海（2003）曾从酱醪中分离到米曲霉、酱油曲霉A. sojae、黑曲霉、高大毛霉M. mucedo 等。张建华（2003）报道自然发酵豆豉中的霉菌数量达107cfu/g，曲霉占真菌总数的90%以上。本研究认为，真菌存在于家庭自制豆酱整个制作过程，尤其在制曲阶段占绝对优势。其中，Penicillium和Aspergillus为优势类群，分别占28.66%和19.43%。通过作者调查和研究认为，酱醅和酱醪上发生的大多数青霉为污染菌，而曲霉与豆酱的发酵直接相关。本文采用稀释平板法，未能从家庭自制豆酱中分离到米曲霉，而分离到了较多的形态上与之相近的黄曲霉，这与Wood（2001）的报导不符。黄曲霉可产生黄曲霉毒素，而米曲霉不产毒素，因二者常发生于各种食品上，因此，准确鉴定真菌种类是非常必要的。为了确认分离到的黄曲霉，作者采用分子生物学方法对两个黄曲霉菌株（IBE05051302、IBE06042802）的ITS rDNA序列进行了分析。比对结果表明，这两个菌株与GenBank中多个黄曲霉菌株相似性达到100%。同时，作者对大连市黑土地酿造厂采用米曲霉纯菌种发酵生产的豆酱进行了米曲霉的再分离和鉴定。通过比较，再次证明作者从家庭自制豆酱样品中分离到的是黄曲霉，而不是米曲霉，其分离频率为16.92%，仅次于A. tubingensis（24.62%）。调查发现，凡黄曲霉分离频率高的豆酱样品，其制作的环境卫生条件都比较差，通常伴有大量杂菌，如青霉Penicillium spp.。由于家庭豆酱制作的环境条件多为开放式，任由空气杂菌发酵，诸如黄曲霉等有害菌难于控制，故传统的家庭自制豆酱存在安全隐患。曲霉是发酵食品中应用最多的真菌，目前用于生产的AS3.350黑曲霉、AS3.324甘薯曲霉A. batatae、AS3.758宇佐美曲霉A. usamii、沪酿3.042米曲霉都是从传统发酵食品中筛选出的优良菌株（牛天娇和马莺 2005）。真菌广泛存在于各种自然环境中，是人类生产、生活的资源宝库，菌物科学要走产、学、研相结合的道路（魏江春 2006）。从自然基质，特别是传统的、特殊的、尚被人们忽略的生境中筛选到的真菌资源极具利用价值。本文研究中分离获得的部分曲霉菌有望用于纯种制曲和特殊风味的豆酱生产或其它经济领域。REFEFENCESBhumiratana A, Flegel TW, Glinsukon T, Somporan W, 1980. 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