分子生物考试答案.doc

1、 使用Trizol 提取RNA时，如何防止RNA酶污染 （基本处理方法和常用的RNA酶抑制剂）？一方面要严格控制外源性RNA酶的污染； 外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶污染.各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。(一) 防止RNA酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6h或更长时间。 2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。 4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。(二)常用的RNA酶抑制剂 1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用2、 简述DNA和RNA浓度检测和纯度估计方法？（1）紫外分光光度法: DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰,可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度(DNA浓度=稀释倍数OD26050).。DNA/RNA纯品的OD260/OD280为1.8或2.0，故根据此值可以估计DNA的纯度。（2）DNA分子的的琼脂糖凝胶电泳检测: 在中性或偏碱性PH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。制胶，加样（PCR产物），电泳，拍照，根据条带判断DNA的浓度。3 简述Polymerase Chain Reaction (PCR)的原理以及PCR体系组成和各组分的作用。(1) 原理：PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。循环进行,使目的DNA得以迅速扩增。（2）PCR反应体系：MasterMix 10ul 上游引物 0.5ul 下游引物 0.5ul ddH2O 7ul 模版 2ul（3）各组分作用：PCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物: 引物就是为了增幅目的DNA而导入的短小DNA片断，在PCR反应中，新合成的DNA是要接在引物上才能继续按照模版DNA复制。，也就是说引物作为DNA复制起始点酶: 是指具有热稳定性的DNA 聚合酶, 主要活性是催化DNA的合成, 其功能是以DNA为复制模板，将DNA由5端点开始复制到3端.dNTP: 三磷酸脱氧核糖核苷的缩写。是dATP, dGTP, dTTP, dCTP的统称。在生物DNA合成，以及PCR中起原料作用。模板：也就是需要扩增的目的片段。Mg2+ ：主要作用为主要是促进聚合酶的活力。Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。4.如何减少PCR污染？PCR阳性、阴性对照的目的各是什么？减少PCR污染的措施： （一）划分操作区 PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行： 1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备； 2. PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增； 3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。 各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。（二）分装试剂 PCR扩增所需要的试剂比如引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，用水应为高压的双蒸水，均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA。 (三) 规范实验操作 1. 戴一次性手套，口罩、帽子，若不小心溅上反应液，立即更换.2. 加样器应该专用，不能交叉使用，使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度； 5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管； PCR阳性对照：它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。PCR阴性对照：包括标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照，以排除标本干扰。试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。5、PCR产物出现拖尾或者涂抹带的原因有哪些？原因:往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，mg2+浓度过高;退火温度过低;循环次数过多引起。对策：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。6、何为Real-Time PCR，操作时有哪些注意事项？概念: Real-Time PCR即实时定量PCR，是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。注意事项 :（1）高质量的RNA获取: 主要是强调RNA的纯度，不能含有基因组DNA,以及其他杂质污染。基因组DNA的存在会导致定量偏高，出现错误的结果，而RNA中的杂质的污染会限制real-time PCR的反应，导致扩增失败，出现假阴性的结果。（2）减少加样误差 : 在使用SYBR Green MIX的时候，一定要先按照反应的量，把所有的试剂一次性配成MIX然后分装，留出5微升的反应体系给模板，为什么要使用5微升，是因为只有5微升以上，加样枪的误差才会比较小，如果你仅仅是吸取一微升的话，手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差，严重影响你的定量精确度。（3）选择合适的内参 : 一般用于定量PCR的内参基因有好几种，但却没有完全通用的内参基因。具体到不同来源的细胞，比如不同组织来源，或者是动物等等，内参基因会有差异，最好的办法是，在你的样品上先测试内参基因，找到变化最小，最稳定的一个。（4）合适的引物设计: 避免出现引物二聚体，非特异性扩增等等7、简述琼脂糖电泳的原理。配置胶时有哪些注意事项？原理: 琼脂糖电泳是以琼脂糖凝胶为支撑物的区带电泳，是分离和纯化DNA 片段的常用技术。由于DNA分子带有含负电荷，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。在凝胶中加入少量荧光染料如溴化乙锭(EB)、Goldview, 其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254365nm波长紫外光照射下，呈现荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。配胶注意事项：(1) 最主要的是要避免气泡。(2) 称量要准确 .（3）加热时候温度不要太高以防液体溅出，必要时可以外面包裹锡箔纸。（4）。8、简述Western blot原理及其与Southern blot的区别（1） Western Blot即蛋白质印迹。基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况.（2）二者区别 A 用途不同 ：Western blot 用于检测蛋白，而Southern blot 是用于检测DNA。B原理不同 ：Western blot是基于抗原抗体之间的特异性的免疫反应，Southern blot是基于DNA分子之间碱基互补配对的特异性识别能力。C 显影方式不同：Western blot首先用“一抗”结合到待检蛋白上，再用，偶联了酶的“二抗”去识别检测“一抗”，最后通过显色反应信号来显示待检测蛋白的存在与否及含量多少。Southern blot则是使用带有标记的DNA 探针去识别并结合到待测核酸上，然后直接显影。9、如何进行组织和细胞蛋白样品的制备及其基本注意事项。细胞蛋白提取: 大致可以分为细胞裂解核酸纯化样品保存几个步骤，详细如下：A 贴壁细胞: 倒掉培养液-用4度预冷PBS洗涤细胞三次-加含有PMSF的裂解液裂解细胞30min (冰上操作)-将细胞碎片和裂解液转移至离心管-离心后收集上清于-20或者-70备用。B 悬浮细胞; 将细胞2500xg离心10miu后弃上清-加入含抑制剂的蛋白抽提试剂-4度裂解20分钟-取裂解液14000 xg 离心15miu-留取上清-20或者-70备用。组织蛋白质提取 : 取少量组织块于匀浆器加含PMSF的裂解液进行充分匀浆(冰上操作)-裂解30miu后取裂解液4度12000rpm 离心5miu-取上清-20或者-70备用.注意事项：1. 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态，且制备方法应具有可重现性。2. 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。3. 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。4. 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。5. 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。6. 在制备蛋白样品的过程中，既需要严谨的技术流程，规范的操作手段来确保蛋白研究的完整性.10、简述Western blot操作步骤及其基本注意事项。简要说明50kd、150kd、260kd蛋白免疫印记的蛋白上样量、配胶浓度、转膜缓冲液浓度、电泳参数、转膜参数（电压、电流、时间）并说明选择依据。流程: 蛋白样品的制备-SDS-PAGE电泳-转膜（PVDF或NC膜）- 封闭-一抗-洗涤-酶标二抗反应-洗涤-显色或化学发光显影。Western bloting要注意的一些问题1、设计对照实验，对照分为：阳性对照（最好有标准品（比如-actin，GAPDH）或阳性血清）；阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）；空白对照（不加一抗，用PBS代替）；无关对照（用无关抗体）2、一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景3、实验设计时所釆用的抗原批次要一样，尽量的避免人为的带来个体差异。特别在做裂解液时更要注意所釆用的操作条件，尽可能的排除可变因素给实验带来不确定性。4、凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。5、电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高；转膜时“三明治”的叠放次序不错，同时要防止产生气泡；尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。6、封闭时一般在室温下2h就够了，但是要注意如果是生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。7、加一抗二抗要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景 不同分子量蛋白上样量（ug）配胶浓度（%）转膜缓冲液浓度（%）电压( V)电流时间(min)50kd30-10012.520%甲醇 不加SDS40恒定40150kd、30-100820%甲醇 10%甲醇40恒定120260kd30-100610%甲醇 0.1%SDS40恒定150选择依据: 分子筛效应，胶的浓度越高，分离越精确，利于分子量小的蛋白质的分离；胶浓度越低，利于大分子量蛋白质的分离。11、简述下图Westernblot结果，分析如何优化实验条件（包括条带特异性、背景处理、抗体的浓度）、一出现非特异性条带：1.一抗不