人参皂苷的规模化生产及应用.doc

人参皂苷的规模化生产及应用辛明 200806044003摘要：皂苷是人参的此生代谢产物，有强身益智、明目、安神等作用。本文阐述了运用规模化细胞培养技术生产皂苷的技术流程以及皂苷的具体应用。关键字：人参皂苷 大规模生产 应用1891年, Kossei提出植物新陈代谢可区分为初生代谢与次生代谢,并认为初生代谢物是存在于所有植物中和维持细胞生命必需的活动;而植物次生代谢物(plant second-arymetabolites, PSM)是植物中初生代谢派生的非植物生长发育所必需、但具有特殊生理功能的小分子有机代谢物质,其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。PSM种类繁多,化学结构迥异,现知1万余种次生代谢物,主要包括酚类、黄酮类、香豆素、木脂素、生物碱、糖苷、萜类、甾类、皂苷、多炔类、有机酸等,可分为酚性化合物、萜烯类化合物、含氮有机物三大类1。次生代谢是植物在长期进化过程中对生态环境适应的结果。植物次生代谢产物具有重要生理活性及药理作用,如生物碱具有抗炎、抗菌、扩张血管、强心、平喘、抗癌等作用;黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、抗艾滋病、抗菌、抗过敏、抗炎等多种生理活性且毒副作用较小2-3。从三角叶薯蓣的培养细胞中产生薯蓣皂甙用于避孕; 金鸡纳细胞培养物产生奎宁用于抗痢疾; 红豆杉细胞培养物产生紫杉醇用于抗癌; 其他有人参、紫草、长春花、罂粟、颠茄、印度萝芙木、天仙子、毛地黄、曼陀罗、三分三、田七等植物细胞培养物产生各种与原植物成分基本一致且同样具有生理活性的化合物。植物是人类赖以生存的食物和药品的重要来源之一,人们已知的3万多种天然产物中有80%来源于高等植物。就药物而言,全美药方中四分之一的药品来源于植物。随着人口的增长和对植物药需求的急剧增加,人们对植物资源进行的掠夺性开发,造成许多植物资源日益枯竭。因此,通过植物细胞、组织或器官培养以满足人类对植物产品的巨大需求,成为当今植物生物技术领域的研究热点之一4。目前已经实现了大规模培养人参细胞来生产皂苷，具体方法如下5。1 高表达细胞株的筛选药用植物细胞培养用的细胞株的筛选过程一般是先通过愈伤组织的诱导，再通过长时期的继代培养，寻找出生长速度快、次生代谢产物积累多的单细胞系，进而培养出遗传稳定性高的细胞株系(图1) 6。1.1 毛状根和冠瘿瘤的培养 图2是毛状根和冠瘿瘤组织培养生产药用植物次生代谢产物的途径6。毛状根培养是20世纪80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术。它是将发根农杆菌的Ri 质粒中含有的 T-DNA 整合到植物细胞的T-DNA 上，诱导植物细胞产生毛状根。这种毛状根具有激素自养的特性，生长迅速，遗传性状稳定。1.2 反义技术采用现代分子生物学技术中的反义技术有可能实现抑制与细胞生长和目的产物积累无关的分支代谢途径从而提高产率。以人工合成的反义RNA 导入到植物基因组内与要抑制的代谢途径的关键酶基因RNA 结合成双链RNA 来阻断基因的正常表达，进而促进目的产物合成基因的表达。图1 由药用植物细胞生产次生代谢产物的路线图2 由植物器官培养生产次生代谢物的路线图3 用于毛状根培养的生物反应器2 培养方法两相培养技术 细胞培养时可采用两相培养技术即细胞培养分离耦合技术，于培养液中加入对细胞无毒性的吸附剂和萃取剂后，再及时将次生代谢产物分离出培养系统，这样可得到较高的产率。目前用得较多的吸附剂主要是XAD-4 和XAD-7，萃取剂主要是十六烷。前体化合物饲喂和诱导子、抑制子的添加也很重要。次生代谢产物的积累量少的一个重要原因在于植物体内合成代谢处于植物代谢的众多分支之中，因此前体化合物的供给不足和信号诱导的缺乏会严重影响次生代谢产物的积累。3 大规模培养人参细胞的生物反应器目前用于药用植物细胞培养的反应器主要有搅拌式、非搅拌式和其他一些类型的生物反应器。用非搅拌式生物反应器培养植物细胞和器官的主要有气升式反应器、转鼓式反应器和各种固定流化床以及膜反应器。药用植物毛状根培养生产次生代谢物常用的生物反应器有雾化反应器、气升式反应器、搅拌反应器、转鼓反应器和鼓泡塔反应器7。常用生物反应器结构如图38所示。4 人参皂苷的应用人参为五加科人参 Panax ginseng C A，Mey 的干燥根，我国现存最早的药物学专著神农百草经中对人参的药用价值有详细的论述，要点是: 强身益智，明目，安神，止惊悸，久服后延年益寿，因其具有神奇而广泛的作用，享有“百草之王”的美誉。其研究和应用已受到国内外的普遍重视。人参总皂苷是人参的主要生物活性成分9。4.1 对中枢神经系统的作用 人参的药理活性常因机体机能状态不同而表现为双向作用，人参皂苷 Rb 类对中枢神经系统有镇静作用，Rg 类有兴奋作用10。人参作用于中枢神经系统通过激活神经保护机制和神经细胞存活机制，提高神经可塑性，通过下丘脑垂体肾上腺轴及下丘脑垂体性腺轴，促进神经发育，调控神经递质、激素和酶的生成释放，提高人体对环境的适应力及有害因子的抵抗力，提高智能和两性功能。4.2 免疫系统 人参皂苷 Rg3 能增强正常小鼠体液免疫功能，部分增强非特异性免疫功能，对细胞免疫无明显影响。人参皂苷 Rg3 还能显著促进淋巴细胞的增殖，以及 NK 细胞和 T淋巴细胞亚群的活性水平11。现代医学研究表明，人参皂苷具有很高的抗肿瘤活性，其中调节细胞产生细胞因子和介导多种免疫效应是人参皂苷发挥抗肿瘤作用的机制之一。4.3 心血管系统 人参具有双向调节血压、强心、保护心肌的作用。对急性心肌梗死、心源性休克、心律失常等危重时期的救治，均有很好的疗效，可明显的降低病死率。刘洁等12通过试验证明人参皂苷 Rg2 能明显增加失血性休克犬血清超氧化物歧化酶( SOD) 的活性，对休克产生的过多的脂质过氧化产物丙二醛( MDA) 有较好的清除作用，对心源性休克犬缺血心肌有明显的保护作用。4.4 内分泌系统 人参无性激素样作用，而能促进垂体分泌促性腺激素，加速大鼠的性成熟过程，或使性已成熟的雌性大鼠的动情期延长，摘除卵巢后此作用消失。人参皂苷有明显的抗应激作用，可明显地抑制小鼠肾上腺、胸腺、脾、甲状腺等器官在应激反应中质量的变化。研究13应用计算机辅助的精子分析系统( CASA) 将不同浓度的人参皂苷 Rb1 体外作用于弱精子症患者的精子，观察其对精子运动的影响，结果人参皂苷Rb1 能明显改善小鼠的性能力。4.5 抗衰老作用 人参抗氧化作用是人参抗衰老作用的重要环节之一，人参具有清除自由基，减少脂质过氧化物产生的作用。人参皂苷 Rb1 具有抑制细胞质过氧化反应、清除自由基的能力、增加过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性。人参水煎剂对衰老小鼠脑组织的基因表达谱具有显著影响，其中Nckapl 基因和 Atp5al 基因可能是人参抗衰老作用的靶基因14。4.6 抗肿瘤作用 近几年发现，人参可提高人体抗 X 射线辐射的保护作用，人参皂苷具有抗肿瘤的作用，并用于肺癌、肝癌、消化道肿瘤等恶性肿瘤的治疗。Rh2 和 Rg3 在动物和人体试验对乳腺瘤、前列腺癌、肝癌和小肠肿瘤有抑制作用，其主要作用机制是提高免疫力、抑制肿瘤血管新生和引起肿瘤细胞凋亡。国内外学者通过研究证实了人参皂苷对多种肿瘤细胞具有生长抑制作用，并阐明该作用是通过诱导分化和引起细胞凋亡而达到的15。国外多采用化学药物来诱导癌细胞凋亡。但是，由于化学药物本身具有一定毒性，除能够诱导癌细胞凋亡外，对机体正常细胞和组织也能带来严重损害。人参皂苷不良反应小，用法简单，值得广泛应用。近年来,在人参、细胞培养、毛状根培养以及反应器的培养等方面取得了突破性进展,上述培养方法虽然能提高人参皂苷含量,但仍存在一些的问题,例如需要的培养条件复杂,成本高,距离药用植物次生代谢产业化的目标还有很大的差距。因此我们需要寻求更合适的培养条件,易于工业化生产的技术方式,以满足人们对人参药材以及人参皂苷类成分的医疗保健需求。参考文献1陈晓亚,刘培.植物次生代谢物的分子生物学及基因工程J.生命科学, 1996, 8(2):8-11.2刘素彦.中药中生物碱类化合物的药代动力学研究进展J.河北医药, 2006, 37(2).3将铁光.黄酮类化合物的构效关系研究纂要J.中医药学刊,2005, 23(2):357-358.4董妍玲,潘学武.植物次生代谢产物简介J.生物学通报,2002,37(11):17-19.5胡凯,谈锋. 药用植物细胞的大规模培养技术J.植物生理学通讯,2004.40(2):251-255.6BourgaudF,GravotA,MilesiSetal.Production of plant second-arymetabolites: ahistorical perspective.PlantSci,2002,161:839-851.7刘春朝,王玉春,欧阳藩等.生物反应器技术用于植物组织培养的研究进展J.化工冶金,1999,20(3):329-326.8HamiltonAJ,LycettGW,GriersinD. An antisense gene that inhibitssynthesis of the hormoneethylene in transgenic plants.Nature,1990,346:284-287.9李勇.人参总皂苷在肿瘤防治中的运用J.中西医结合学报,2004,2(3):171-17210魏建华,张延强,于淑莲.吉林长白山人参单体皂苷作用解析J.人参研究,2005,17( 3) : 7.11王华庆,张会来,姚智,等.人参皂苷 Rg2 促进自体外周血干细胞移植后免疫重建的临床观察J.中华微生物学和免疫学杂志,2006,26( 6) : 508-