生化试验.doc

标准曲线：又称校正曲线或工作曲线，是比色分析法中不可缺少的步骤，从浓度-光密度值直线的直线特性，可判断所采用方法的成色反应是否符合Lambert-Beer定律Lambert-Beer定律： Lambert-Beer 定律是说明物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度（C）和 液层厚度（l）间的关系的定律，是光吸收的基本定律，是紫外-可见光度法定量的基础。双缩脲法：原理：蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中能与Cu2+反应生成紫红色化合物，在1-10mg/ml的范围内，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比。优点：操作简便、迅速，受蛋白质种类性质的影响较小缺点;灵敏度差，特异性不高，除与-CONH-由此反应外，还与-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团有此反应。试剂：蛋白质标准液、待测血清样本、生理盐水、双缩脲试剂紫外分光光度法：原理：蛋白质分子中含共轭双键的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，其吸收高峰在280nm处，但核酸在280nm处也有一定吸收能力，其吸收峰最大值在260nm处，经经验公式校正，可推算出蛋白质的真实含量。优点：操作简便、迅速，蛋白质不损失，可回收缺点;结果不准确，仅可作为粗略的测定方式试剂：血清样本、生理盐水BCA法：原理：碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合两个BCA分子，试剂从原来的苹果绿变成紫色复合物，在一定范围内，颜色深浅与蛋白质成正比。优点：操作简便、快速，灵敏度高，准确，试剂稳定，经济实用，抗干扰能力强。缺点：反应时间长且蛋白质也会发生不可逆的变性。试剂：蛋白质标准液、待测样本、双蒸水、BCA工作液米氏常数测定的原理：在酶促反应中，当反应体系的温度、 pH及酶浓度恒定时，底物浓度对反应速率的影响呈矩形双曲线关系，AKP催化磷酸苯二钠水解产生游离酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌衍生物分子筛：凝胶支持物结构的孔隙对带电颗粒分子产生阻力，分子大的在凝胶中泳动速度慢，分子小的泳动速度快。层析技术的基本概念：又称色谱法，是一种重要的分离分析手段，利用混合物中各组分的吸附力、带电性、相对分子质量、极性或生物活性等差异，当固定相和流动相相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到溶解、析出、吸附、脱附等作用从而以不同速度相对固定相移动而达到分离。血清-球蛋白的分离纯化与鉴定的实验原理：1.盐析法：利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐中溶解度的差异，将球蛋白沉淀析出。2.凝胶层析法：利用蛋白质和无机盐间分子质量的差异，将小分子的盐洗脱出来3.DEAE纤维素阴离子交换层析柱：利用各种球蛋白间等电点的差异，将-球蛋白洗脱出来。方法、操作：盐析脱盐（装柱-上样-洗脱-收集-蛋白质和NH4+的检查）纯化（装柱-上样-洗脱-收集-蛋白质的检查）浓缩纯度测定分子质量测定免疫学活性鉴定及注意事项SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量（计划学时数：5学时）原理：SDS与蛋白质混合，重量比达到1.4:1时，使蛋白质变性解离成单一亚基，形成SDS-蛋白质负离子，电泳时，蛋白质的迁移率和相对分子质量的对数呈直线关系B液：PH=6.8 C液：PH=8.8操作：凝胶制备加样电泳染色脱色测定注意事项：1.凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。2.多余的上样槽不能空，加入等量上样缓冲液3） estern blotting检测血清IgG（计划学时数：5学时）原理：经SDS-PAGE,将待测样品转移到固相支持体上（常为NC膜），膜可与抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）反应，后可与有标记的二抗结合进行检测，本实验直接使用辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体直接检测人血清IgG，无需使用抗体，漂洗后可加入生色底物进行特异性显带。操作：SDS-PAGE组装：正极-海绵-3层滤纸-NC膜-凝胶-3层滤纸-海绵-负极（胶负膜正）拆下装置，用考马斯亮蓝染液染色，检查蛋白质转移是否完全；用丽春红S对NC膜染色至蛋白带出现NC膜放入塑料袋，加入封闭液，摇床温浴将封闭过的NC膜放入另一袋中，加抗体稀释液，摇床将NC膜转移至盛有漂洗液的托盘上，摇动漂洗三次加入生色底物，一旦蛋白带的颜色达到要求，立即取出NC膜葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度的原理及操作注意事项原理：葡萄糖氧化酶利用空气和水催化葡萄糖分子中的醛基氧化，生成葡萄糖酸并释放过氧化氢。过氧化氢酶在有氧受体时，将过氧化氢分解为水和氧。后者将还原性氧受体4-氨基安替吡啉和酚氧化，缩合生成红色醌类化合物。醌的生成量与葡萄糖量成正比。因此。将测定样品与经过同样处理的葡萄糖标准液进行比色，即可计算出血糖的含量。注意事项：由于温度对本实验影响较大，水浴时应严格控制温度，防止酶活性丧失。碱裂解法小量制备质粒DNA的方法原理：十二烷基磺酸钠(SDS) 可使细胞膜裂解。经SDS处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA和蛋白质变性，而共价闭合环状DNA（cccDNA)的两条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。溶液I：重悬细菌葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀Tris-HCL：缓冲体系EDTA：螯合金属离子，抑制DNase溶液II：破膜，变性基因组DNA和蛋白质SDS：破膜作用，解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性NAOH：破坏氢键，变性基因组DNA溶液III：中和溶液，复性质粒DNA（2）酚:氯仿纯化DNA原理：酚：变性蛋白质 氯仿：萃取溶液中的酚乙醇：沉淀得到高质量的DNA（3）DNA琼脂糖凝胶电泳原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛，常用于凝胶层析和电泳。线性DNA分子在电场中分子越大，受到的摩擦阻力越大，迁移速度越慢。因此DNA在凝胶中获得有效的分离并测得其分子量大小。荧光染料溴化乙啶（EB）通过插入DNA双螺旋结构两个碱基之间，与DNA形成荧光络合物，可确定DNA在凝胶中的位置；而发射的荧光强度正比于DNA的含量，与已知浓度的标准品作电泳对照，可估算出待测样品的浓度。超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的是复制中间体。感受态细菌：受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。质粒DNA：细菌染色体以外的遗传物质，是环状闭合的双链DNA，存在于细胞质中，具有自我复制的能力，所携带的遗传信息能赋予宿主菌某些生物学性状。转化: 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 蓝白筛选：是在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆的方法。-互补现象：各自都没有酶活性的两种肽段可以融为一体，形成具有酶活性的蛋白质的现象。重组子：两个突变位点之间可发生交换产生野生型的最小单位，即不能由重组分开的基本单位。1）大肠杆菌感受态细胞的制备方法1、Top10菌株培养过夜，以1:100比例接种培养3小时，冰浴30min，分装于EP管，2500rpm 4离心4min。2、弃上清，沉淀重悬于1ml预冷0.1mol/L CaCl2 ，冰浴15min，2500rpm 4 离心4min。3、弃上清，沉淀轻悬于0.2ml预冷0.1mol/L CaCl2 (此时细菌易破碎)，置冰浴。（2）质粒DNA的转化转化的方法有：化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞步骤：1、在消毒过的管中，加30100ng外源DNA与200ul感受态细胞混匀。 2、冰浴30min 3、将管转移到42水浴中加热冲击2min使之热休克，或用37水浴5min。 4、加800ul LB培养基在37摇动或在摇床转动生长45min，转速不超过220r/min，使抗性基因表达。（3）重组子的蓝白筛选原理：利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。当在质粒中插入外源DNA-半乳糖苷酶的N端基因失活不能与宿主-半乳糖苷酶的C端进行-互补产生白色菌落。 反之，能进行-互补的细菌表达： -半乳糖苷酶活性，形成蓝色菌落。（4）凝胶中DNA的回收 （熟悉）在生物技术试验中，PCR反应获得的目的片段，酶切后所得特定的DNA序列，分子杂交中所制备的探针等，经过电泳后，目的片段要与其它DNA分开，这就需要有一套方法将目的DNA从凝胶中分类出来，通过处理后得到纯化的目的DNA，以用于以后分子杂交，序列分析等。常用技术有：电洗脱法，低熔点琼脂糖凝胶法，DEAE滤膜插片法等，其中电洗脱法经济节省，操作方便，对DNA的回收效果好。RNA的提取：有五个关键点1、