酶工程文档.doc

第一章 酶工程基础 一酶的催化特点（一）酶和一般催化剂的共性：1、用量少而催化效率高；2、它能够改变化学反应的速度，但是不能改变化学反应平衡。3、酶能够稳定底物形成的过渡状态，降低反应的活化能，从而加速反应的进行。（二）酶催化作用特性：1、高效性；2、专一性；3、调节性1 高效性：酶加速反应的机理是降低反应的活化能。活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。2 专一性：又称为特异性，是指酶在催化生化反应时对底物的选择性。3 调节性：1. 酶浓度的调节 2 激素调节 3. 共价修饰调节 4. 限制性蛋白水解作用与酶活力调控 5. 抑制剂的调节 6. 反馈调节 7. 金属离子和其他小分子化合物的调节第2节 酶的活力测定1、 酶活力与酶促反应速度 酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应速酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量单位：浓度/单位时间2、酶的活力单位（U）1国际单位（IU单位）：在最适反应条件下，每分钟催化1umol底物转化为产物所需的酶量，称一个国际单位（IU），1 IU = 1umol /min1单位催量（Katal, Kat单位）：在最适反应条件下，每秒钟催化1mol底物转化为 产物所需的酶量，称Kat单位。1 Kat=1mol/s=60mol/min=6X 107 IU3、酶的比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位：U/mg蛋白质。酶的比活力=酶活力单位/mg（蛋白质或RNA）酶的比活力是分析酶的含量与纯度的重要指标。酶提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。酶的纯化倍数： 酶的回收率： 100% 第3节 酶反应动力学1、 米氏方程：反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即氏方程 Km 即为米氏常数，Vmax为最大反应速度1. Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。VmaxVSKmVmax/2 2. Km可近似表示酶对底物的亲和力； 当K2 K3时， Km Ks 3.Km是酶的特征性常数之一一般只与酶的性质、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。米氏方程的意义：1米氏常数为反应速度是最大反应速度一半时的底物浓度，Km单位为摩尔浓度（mol/L）2Km对于特定的反应条件而言是一个特征常数。它只与酶的性质有关而与酶的浓度无关，不同的酶，具有不同的Km值。3Km值作为常数只是对固定的底物、一定的温度、一定的pH等条件而言的。4Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高，因此可以判断酶的最适底物。5催化可逆反应的酶正逆方向反应的Km是不相同的，测定细胞内Km和正逆方向反应的底物浓度，可大致推测正逆反应的效率，判断酶在细胞内的催化的主要方向.4. Vmax：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。意义：Vmax=K3 E如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算酶的转换数(turnover number)，即动力学常数K3。第二章 酶的发酵工程 1.诱导 (1)组成酶：细胞固有的酶类。 (2)诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。1. 酶合成的诱导:加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。酶合成诱导的现象：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶； b-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：(1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述酶合成；（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述酶合成；（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。2.阻遏:(1)分解代谢物阻遏 (2)反馈阻遏2.末端产物阻遏:由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。酶合成阻遏的现象：实验：（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比3分解代谢物阻遏(1)指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。(2)分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。第三节 酶发酵动力学 一、细胞生长动力学:在分批培养过程中，细胞生长一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰亡期5个阶段。营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：Monod模型:比生长速率（1/h） （specific growth rate）max：最大比生长速率（1/h）S：营养物浓度（生长限制基质浓度） 克/LKs：莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数 克/L，或 mol/L 二、产酶动力学 （1） 酶生物合成的模式根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为3种模式，即： 生长偶联型 同步合成型; 中期合成型 部分生长偶联型延续合成型 非生长偶联型 滞后合成型1. 生长偶联型（又称同步合成型）:酶的生物合成与细胞生长同步。特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。 当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。生长偶联型中的特殊形式中期合成型:酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的mRNA是不稳定的。2.部分生长偶联型（又称延续合成型）: 酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。所对应的mRNA相当稳定。3. 非生长偶联型（又称滞后合成型）:只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点：受分解代谢物的阻遏作用。所对应的mRNA稳定性高。 酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度 。滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面努力。 (二) 产酶动力学一般产酶动力学方程可表达为：式中 X细胞浓度(g /L) m细胞比生长速率(h-1） a生长偶联的比产酶系数(IU/g) b非生长偶联的比产酶速率(IU/(gh) E酶浓度(IU/L) t时间(h)生长偶联型部分生长偶联型 非生长偶联型第三章 酶的分离工程3.1 酶的提取、分离纯化技术路线（预处理）细胞破碎（动物,植物或微生物细胞）（粗粉级分离）酶提取（发酵液） （细分级分离）酶分离纯化（离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等）（成品加工）酶浓缩 酶贮存酶分离纯化不同阶段：酶的纯化过程，约可分为三个阶段：(1) 粗蛋白质 : 采样 均质打破细胞 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。(2) 部分纯化: 初步的纯化，使用各钟 柱层析法。(3) 均质酶: 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。 第四章 固定化酶与固定化细胞第1节 概述固定化细胞技术： 二 固定化酶的优缺点优点：多次使用；可以装塔连续反应；纯化简单；提高产物质量；应用范围广缺点：首次投入成本高；大分子底物较困难1 一般方法及特点1 四大类方法：吸附法（包括电吸附法）；结合法（无机多孔材料）；交联法（双功能试剂）；包埋法（微胶囊法） 各类固定化方法的特点比较: 比较项目吸附法结合法 交联法包埋法物理吸附.共价键结合离子键结合 制备难易易难易 较难较难固定化程度弱强中等 强强活力回收率较高低高 中等高载体再生可能不可能可能 不可能不可能费用低高低 中等低底物专一性不变可变不变 可变不变适用性酶源多较广广泛 较广小分子底物、药用酶 2 选择方法依据：（1）酶的性质（2）载体的性质（3）制备方法的选择（1） 吸附法1 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。 2. 常用载体：（1）无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、金属氧化物、硅胶。一般吸附量1mg蛋白/克吸附剂（2）有机载体：淀粉、白蛋白等。一般吸附量几十毫克蛋白/克吸附剂研究热点：大孔型合成树脂、陶瓷（二）结合法1. 离子键结合法2. 共价键结合法1. 离子键结合法：酶分子与载体之间以离子键作用而实现结合的固定化方法常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶使用注意：pH、离子强度、温度2 .共价键结合法：酶分子与载体之间以共价键作用而实现结合的固定化方法（2） 可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键（3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体4）载体活化的方法：A重氮法B叠氮法C烷基化反应法D硅烷化法E溴化氰法（三）交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。用处：可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。（三）交联法的形式：（1）酶直接交联法（2）酶辅助蛋白交联酶直接交联法： 在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。影响因素：固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。酶辅助蛋白交联：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个载体蛋白质.双重固定法：（1） 吸附交联法（2） 交联包埋法（1） 吸附交联法：先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。（2）交联包埋法：把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。优点：这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。（四） 包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。包埋法分为网格型和微囊型1网格型：将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。2微囊型包埋法：是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。 微囊化法制备固定化酶有两种方法 界面沉淀法：这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。此法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。界面聚合法：是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。双功能试剂：第5章 化学酶工程第1节 酶分子的化学修饰（一）概述：通过主链的“切割”“剪接”和侧链基团的“化学修饰”对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质活性，这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术 一 酶的化学修饰原因：1稳定性不够，不能适应大量生产的需要。（热、蛋白）2作用的最适条件不符。（半衰期延长，最适PH扩大）3酶的主要动力学性质的不适应。（Km增大，结合差）4临床应用的特殊要求。(异源蛋白-抗原-抗体-降低酶类药物抗原性） 三 酶化学修饰的基本原理（解决4个“ ？”） 1如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性2如何保护酶活性部位与抗抑制剂3如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶4如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境酶化学修饰的定义：凡通过化学基团的引入或除去，而使酶蛋白共价结构发生改变，称为蛋白的化学修饰。第2节 抗体酶抗体：由抗原诱导产生的，在结构上与抗原高度互补并与抗原具有特异结合功能的免疫球蛋白。抗体的最显著的特征是：多样性和专一性抗体酶：抗体酶或催化抗体一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。抗体酶具有典型的酶反应特性：1与配体(底物)结合的专一性，包括立体专一性，抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性；2具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快102106倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度；3抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。 抗体酶的制备：将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、化学修饰法等途径。诱导法：是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶。拷贝法：主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的。引入法：则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能。化学修饰法：对抗体进行化学修饰，使抗体与催化基团相连。 第六章 生物酶工程 酶的定点突变：指在基因的特定位点引入突变，即通过取代、插入或删除已知DNA序列中特定核苷酸序列来改变蛋白质中某个或某些特定的氨基酸，以此来提高酶对底物的亲和力，增强酶的专一性。定向进化：属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。 定向进化：突变 筛选突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变的效应更是不可预知的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的， 生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。定点突变：突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。第7章 核 酶剪切型核酶剪接型核酶根据催化反应锤头型核酶组I内含子组II内含子发夹型核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶核酶：由于这类酶具有类似核糖核酸酶功能，而化学本质为核酸，因此被切赫称之为核酶。核酶的类型：1剪切型核酶：这类核酶催化自身或者异体RNA的切割，相当于核酸内切酶。2剪接型核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性。第三节 核酶的应用1、核酶抗肝炎病毒的研究2、抗人类免疫缺陷病毒型（HIV- )核酶3、抗肿瘤治疗 第八章 非水相酶催化一有机相酶反应的优点：1有利于疏水性底物的反应。2可提高酶的热稳定性，扩大反应pH值的适应性。3可改变反应平衡移动方向,能催化在水中不能进行的反应。4可控制底物专一性，可防止由水引起的副反应。5酶易于实现固定化。6酶和产物易于回收。（低沸点溶剂更易分离纯化产物)7可避免微生物污染。反应体系中水对酶催化反应的影响：（1）酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。 （2）酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。故此，酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水。（3）有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。存在最适水含量。酶催化反应的主要介质和种类：第9章 酶反应器和酶传感器常见的酶反应器类型:按结构区分搅拌罐式反应器;填充床式反应器;流化床式反应器;膜反应器按操作方式区分:分批式反应;连续式反应;流加分批式反应混合形式:连续搅拌罐反应器;分批搅拌罐反应器影响酶反应器选择的因素很多，但一般可以从以下几个方面考虑：1酶的形式(游离/固定化.)2固定化酶的形状3底物的物理性质4酶反应动力学性质5酶的稳定性6操作要求7反应器制造、控制成本第10章 酶抑制剂 第1节 酶的抑制剂及抑制作用酶的抑制剂:凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的抑制剂。注意：区别于酶的变性抑制剂对酶有一定选择性，而变性的因素对酶没有选择性3. 抑制作用的分类:抑制作用类型:1不可逆性抑制;2可逆性抑制可逆性抑制:1竞争性抑制;2非竞争性抑制；3反竞争性抑制 1不可逆抑制作用：抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活，不能用透析、超滤