《基因工程抗体》PPT课件.ppt

基因工程抗体 根据研究者的意图 采用基因工程方法 在基因水平 对免疫球蛋白基因进行切割 拼接或修饰后导入受体细胞进行表达 产生新型抗体 主要包括嵌合抗体 单链抗体 人源化抗体 双价抗体和双特异性抗体等 Geneticengineeringantibody 单克隆抗体用于治疗存在的问题 1 单克隆抗体的特异性由于肿瘤特异性抗原较少 缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗 对正常组织有交叉反应 2 异种抗体反应鼠源性单抗用于人体 导致异源性超敏反应 理想的抗体药物的性质 高特异性和高亲和力 Kd 108 1010L M 对人没有免疫原性 不诱导机体对抗体的排斥反应游离抗体不激活补体一旦结合到靶抗原上 能诱导效应功能细胞系稳定 适合在无血清培养基中进行大规模培养抗体符合生物制品标准 问题异源蛋白导致产生抗抗体 影响靶向性和效果靶部位摄取的量太低效应功能弱在体内被清除速度快 对策抗体人源化改变抗体分子大小连接毒素 放射性同位素 药物抗体人源化 抗体治疗存在的问题及对策 抗体药物改造的方向 抗体人源化和人源抗体制备改变抗体分子大小增强抗体亲和力增强抗体效应功能 单克隆抗体人源化的改进 鼠抗体人源化 人 鼠嵌合 改型抗体 小分子抗体 Fab 单链 单域 超变区多肽 基因工程抗体 双特异 免疫黏连素 催化抗体 人源抗体 噬菌体抗体库 转基因小鼠 人 人抗体 1 抗体人源化鼠单克隆抗体人源化 嵌合抗体 改型抗体小分子抗体 单价 Fab ScFv 单域抗体 超变区多肽 多价 Di Tri Minibody 特殊类型抗体 双特异性抗体 细胞内抗体 抗原化抗体 免疫脂质体 抗体融合蛋白 免疫粘连素 免疫毒素 催化抗体 VH和VL是抗原决定簇结合位点高变区HVR决定簇互补区CDR骨架区FRCH1和CL Ig同种异型的遗传标志CH2 补体结合位点CH3 某些细胞Fc受体结合部位 第一代的抗体人源化 嵌合抗体从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因 与人Ig恒定区 决定免疫原性 基因连接 插入适当表达载体 转染宿主细胞 表达人 鼠嵌合抗体 嵌合抗体由于这两部分在空间结构上相对独立 其独特的抗体亲和力保持得很好 但因鼠单抗可变区的存在 应用时仍有较强的免疫排斥反应 特点 减少了鼠源性抗体的免疫原性 同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力 Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL 免疫球蛋白基因载体的构建 H链嵌合载体 L链嵌合载体 共转染细胞 启动子 人 鼠嵌合抗体基因工程改造策略 鼠VH 鼠VL 人CL 人CH 抗体分泌细胞 人 鼠嵌合基因工程抗体 第二代的抗体人源化 改型抗体 在嵌合抗体的基础上进一步将鼠MAb可变区中相对保守的FR frameworkregion 替换成人的FR 保留与抗原结合部位决定簇互补区 complementdeterminantregion 部位 即CDR移植 早期的改型抗体 简单的CDR移植 通过点突变进行微调即更换某个位点上的氨基酸 第二代改型抗体 应用了人抗体基因库 引进计算机技术模拟抗体分子的立体结构 分子模拟法 使用了鼠人嵌合FR 其目的是获得具有高亲和力的治疗性抗体 CDR序列 CDR序列 鼠单克隆抗体 人抗体 人源化抗体 鼠单克隆V区人源化 CDR移植 小分子抗体人源化抗体属完全的抗体分子 通过基因重组技术 可以在保持原有抗原结合活性的基础上 把完整的抗体分子改造成较小的分子 称为小分子抗体 根据其价数的不同可分为单价小分子抗体及多价小分子抗体两种 单价小分子抗体一 Fab抗体Fab段由重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成 主要发挥抗体的抗原结合功能 Fab抗体只有完整IgG的1 3 二 单链抗体 ScFv 定义 用基因工程方法 将抗体VH和VL 重链和轻链可变区 通过一个连接肽连接而成的小分子抗体 功能 具有较好的抗原结合能力 且分子量小 穿透力强 免疫原性低等特性 可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子 是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件 ScFv应用 用于肿瘤的导向治疗肿瘤的影像分布基因治疗研究基因结构与功能的关系 三 单域抗体抗体与抗原的结合主要由Ig的V区决定 因此只含V区基因片段的小分子抗体 即只有VH或VL一个功能结构域 也能保持原单克隆抗体的特异性 这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体 其分子量仅为整个Ig分子的1 12 故也称之为小抗体 四 超变区多肽 hypervariableregionpolypeptides 抗体抗原结合是经过补体决定区 CDR 来实现 因此 CDR是构成抗原抗体结合的最小结构单位 根据这一特点 可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDR多肽 直接用于诊断或治疗 可望获得理想的结果 这种只含有一个CDR多肽的抗体 称为超变区多肽 亦称为最小识别单位 minimalrecognitionunit MRU 多价小分子抗体在ScFv的基础上 可以把两个或两个以上的ScFv重组在一起 由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体 简称多价微抗 其中包括双链抗体 diabody 微型抗体 minibody 三链抗体 triabody 及四链抗体 tetrabody 等 一 双链抗体 diabody 制备方法化学交联法粘性蛋白结构域融合法接头长度控制法 二 三链抗体 triabody 在制备单链抗体时 当接头的长度为2个或2个的以下氨基酸残基时 或者直接把VH结构域的N末端与VL结构域的C末端相连 通过非共价键而形成的三聚体 称为三链抗体 接头长度在3 12个氨基酸残基时 则形成双链抗体 三 微型抗体 minibody 通过基因工程手段采用不同的接头把单链抗体 VL VH 的VH结构域与IgG的CH3结构域融合 形成VL VH CH3的结构 称之为微型抗体 minibody 此种抗体合成后通过CH3结构域形成稳定二聚体式 发挥其双价微抗作用 四 双特异性抗体 BfAb 天然Ig是由两个完全相同的VL和VH区域构成 该区域是特异性识别并结合抗原的关键部位 而经人工设计构建的双特异性抗体 BsAb 则由两个不同的抗原结合位点组成 可同时与两种不同的抗原决定簇结合 并可将其偶连的药物 酶或放射性核素等导向到靶部位 这种具有双价双特异性的抗体又称为双功能抗体 bifunctionalantibody BfAb 双特异性抗体的特点将免疫细胞锚着于肿瘤部位 提高肿瘤部位的效靶比 不受MHC的限制 直接激活免疫细胞的杀瘤机制 1 2 3 提高抗体效应功能 抗体融合蛋白 抗体的一部分被非抗体序列替代 所形成的具有新的特性融合蛋白 根据构建方式的不同 主要分为两种形式 Fc融合蛋白 Fcfusionprotein FcFP 由抗体的Fc段与某些具有特定功能的蛋白结构域融合而成 如CD4免疫粘附素 就是由抗体的Fc段与2个CD4分子的Ig同源区重组而成抗原结合融合蛋白 antigen Bindingfusionprotein ABFP 由具有抗原结合功能的抗体结构与其他功能性蛋白融合构成 如免疫毒素 抗体部分主要包括嵌合抗体 单链抗体形式 免疫粘附素 immunoadhension 将人抗体恒定区 主要是Fc段 N 端连接于人细胞表面的受体分子或细胞粘附分子上 在真核细胞中表达出正确折叠的融合抗体蛋白分子 这种分子可同时发挥抗体的效应功能及其它相应的效应功能 这种分子又被称为新效能抗体 免疫毒素 又称生物导弹 是由导向性的载体分子与具有毒性的弹头蛋白交联而制成 属于导向药物的一种 偶连细胞毒物质 连接放射性同位素 131I 99mTc 连接植物或细菌毒素 ricin PE40 连接细胞毒性药物 C1027 柔红霉素 免疫毒素 C C V C V C C C SPDP SPDP RicinA RicinA Fc RI RicinA RicinA 蓖麻毒素A 对肿瘤细胞具有毒性作用 CH1 CH2 CH3 IL 2 scFv IL 2 免疫细胞因子 Immunocytokine 五 细胞内抗体细胞内抗体主要是指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体 亦称内抗体 intrabody 目前的研究主要集中在单链抗体上 在ScFv的C端或N端插入其它靶向信号 targetingsignals 如分泌信号 核定位信号 线粒体定位信号和内质网滞留信号等 从而进行检测 识别 发挥特定功能 细胞内抗体的应用 由于细胞内抗体具有高亲和力及选择结合特性 因而可通过多种机制调控细胞的生理过程及代谢 作用机理表现为 阻断靶蛋白的活性部位阻断细胞内蛋白 蛋白相互作用干扰细胞内靶蛋白的转运促使靶蛋白降解 六 抗原化抗体 antigenizedantibody AbAg AbAg是应用基因工程技术 把编码蛋白质抗原表位的核苷酸片段插入重链CDR3序列中进行表达 从而产生具有天然抗原表位构象和免疫原性的新型抗体 今后抗体药物发展的方向 寻找新的靶抗原基于抗原立体结构设计抗体基于抗原 抗体相互作用设计小分子抗体模拟物 最理想的单克隆抗体 100 人源人类免疫系统自然产生 25年来的全人抗体的尝试 鼠骨髓瘤不适合与人B细胞融合稳定性差抗体产量低非洲淋巴细胞瘤病毒 EBV 保存抗体分泌细胞细胞株不稳定抗体的产量低不能特异性地保存抗体分泌细胞很难获得人类骨髓瘤细胞株 成功建立人骨