液相色谱-蒸发光散射-电喷雾离子阱质谱法测定硫酸依替米星及其有关物质.doc

液相色谱-蒸发光散射-电喷雾离子阱质谱法测定硫酸依替米星及其有关物质袁耀佐1 张玫1*作者简介 袁耀佐，男，1968.03.10，博士，副主任药师， 主要从事抗生素药物质量分析；*通讯作者 张玫，女，1960.03.17，硕士，主任药师，主要从事抗生素药物质量分析，，Tel 钱文1 谭力1 严菲1 张正行2（1 江苏省食品药品检验所，南京 210008 ）（2 中国药科大学药物分析教研室，南京 210009 ）摘要：目的 建立液相色谱-蒸发光散射法（HPLC-ELSD）测定硫酸依替米星含量和有关物质,采用液相色谱-电喷雾离子阱质谱法（HPLC-ESI-MSn）对硫酸依替米星成品中的有关物质进行鉴定。方法 采用Gemini NX C18(4.6mm150mm, 5m)色谱柱，以水-氨水-冰醋酸（96：3.6：0.4）-甲醇（70：30）为流动相，流速1.0ml/min，漂移管温度105，载气流量2.6L/min；质谱条件：ESI离子源，离子源温度350，雾化室压力40 psi，干燥气流速10 L /min，正离子检测方式；解析依替米星的二级质谱,归纳同类化合物质谱裂解规律,借助该规律用一级质谱和二级质谱进行有关物质的结构推测和解析。结果 依替米星与有关物质分离良好，依替米星在0.050861.0173g/L范围内呈较好的线性（r=0.999），重复性实验RSD=1.8%,检出限为10g/ml。用新建立的方法，从硫酸依替米星成品中检出约18个有关物质，解析结果显示，这些有关物质中，有3个依替米星同分异构体、4个小诺霉素同分异构体、2个依替米星降解物、2个依替米星同系物等；对14个有关物质进行了解析，其中庆大霉素C1a、小诺霉素、依替米星同分异构体、依替米星降解物和另外2个组分的结构得到了确证，还有部分有关物质的结构除某些取代基的取代位置不能肯定外也基本得到鉴定，但也有4个有关物质无法解析，只提供了分子量和二级质谱信息。结论 建立的方法简便、快速、准确，为依替米星质量控制和工艺优化研究提供了可靠的分析手段。关键词：硫酸依替米星；高效液相色谱法，蒸发光散射检测器；电喷雾离子阱质谱Analysis of Etimicin Sulfate and Its Related Substances by High Performance Liquid Chromatography Using Evaporative LightScattering Detection and Electrospray Ion Trap Mass SpectrometryYuan Yao-zuo1, Zhang Mei1*, Qian Wen1,Tan Li1, Yan Fei and Zhang Zheng-xing2（1. Jiangsu Institute for food and drug control, Nanjing 210008）（2. Department of Pharmaceutical Analysis, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009)Abstract Objectives To establish a HPLC-ELSD method for the determination of etimicinsulfate and its related substances, to identify the related substances in etimicinsulfate by using HPLC-ESI-MSn. Methods the column is Gemini NX C18(4.6mm150mm, 5m), the mobile phase is H2O-ammonia-glacial acetic acid(96：3.6：0.4）)-methanol(70:30), the flow rate of mobile phase is 1ml/min, the drift tube temperature was 105, the flow rate of nebulizing gas is 2.6L/min. the temperature of ESI ion source is 350, nebulizing pressure is 40 psi, dry gas flow is 10 L /min. some related substances in etimicinsulfate were elucidatedd by analyzing their MS and MS2 fragmentation with the help of a rule summarized from the elucidation of MS2 fragmentation of etimicin. Results Good separation of etimicin and main related substances could be achieved. The standard curve was rectilinear in the range of 0.050861.0173g/L ( r = 0.9998). The RSD of repeatability was1.8%. The limit of detection was 10 mg/L. Eighteen related substances in etimicinsulfate were separated and detected. by HPLC-ESI-MSn ,fourteen related substances were elucidated, they are gentamicin C1a, micronomicin and three of its isomers, three of etimicins isomers, two degradation products of etimicin , two homolog of etimicin, and two other unknown compounds, the other four related substances can not be elucidated by our MS data. Conclusions The method is simple, rapid, and could be used to control the quality of etimicinsulfate Key words Etimicinsulfate, high performance liquid chromatography, evaporative light scattering detector, electrospray ion trap mass spectrometry1 引言硫酸依替米星(etimicinsulfate) 是我国科研人员独立研制开发的具有自主知识产权的半合成氨基苷类抗生素,具有高效、安全、广谱抗菌、无交叉耐药性等特点,耳肾毒性明显低于同类产品，且化学稳定性更好1，被中国药典2005年版二部收载，含量测定方法采用HPLC-ELSD方法，有关物质检查采用薄层色谱法2。05版药典含量测定方法采用的0.2mol/L三氟乙酸-甲醇（84:16）为流动相,三氟乙酸对检测器有强腐蚀性，且不适合电喷雾（ESI+）质谱分析，本文在相关文献的启发下3，采用宽pH范围色谱柱，在碱性条件下建立了适合HPLC-ELSD-ESI-MSn分析的色谱条件，用于含量和有关物质测定，并用多级质谱样品中的有关物质进行结构鉴定。2 实验部分2.1 仪器与试剂LC-10ADvp色谱系统（SHIMADZU公司）和Alltech ELSD2000型蒸发光闪射检测器（Alltech公司），Agilent 1100 LC /MSD Trap液质联用仪（Agilent 公司）。硫酸依替米星(080103、080104、080105)、庆大霉素C1a、中间体P1等均为常州方圆制药有限公司提供，西索米星、小诺霉素、庆大霉素C组分等标准品均由中国药品生物制品检定所提供，乙腈为色谱纯试剂，其余试剂均为分析纯试剂。2.2 实验方法2.2.1 液相色谱条件 色谱柱：Gemini NX C18(4.6mm150mm, 5m)；以水-氨水-冰醋酸（96：3.6：0.4）-甲醇（70：30）为流动相；流速：1ml/min；柱温：35 ；进样量：20l；采用蒸发光散射检测器;漂移管温度:105; 载气流速：2.6L/min;进行质谱分析采用分流模式，分流比为7：3。2.2.2 质谱条件：离子源为ESI源；离子源温度：350；雾化室压力：40 psi；干燥气流速：10 L /min；离子扫描范围: 100900m / z;正离子方式检测,采用全扫描一级质谱( Full scan)和离子全扫描二级质谱( Full scanMS2 ) 2种方式同时测定。2.2.3 有关物质测定方法 取本品适量,精密称定,加水溶解并定量稀释制成每1 mL中含依替米星10.0mg的供试品溶液;另取依替米星对照品适量,精密称定,分别加水制成每1 mL中含依替米星0.05、0.1和0.25mg的对照溶液。按2.2.1项下的色谱条件进行实验,准确量取上述两种溶液各20L,分别注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。以对照溶液依替米星峰峰面积的对数和对照溶液浓度的对数制备随行标准曲线;供试品溶液中单个杂质及总杂质的含量以峰面积的对数按随行标准曲线法计算。2.2.4 含量测定方法 取依替米星对照品适量，精密称定,分别加水制成每1mL中含依替米星0.25、0.5和1.0mg的对照品溶液。精密量取上述3种对照品溶液各20L注入液相色谱仪,记录色谱图。以对照溶液依替米星峰峰面积的对数和对照溶液浓度的对数制备随行标准曲线;另取本品适量,精密称定,加水溶解并定量稀释制成每1 mL中约含依替米星0.5 mg的溶液,同法测定,按随行标准曲线法计算,即得。3 实验结果3.1 色谱条件与检测条件的选择与优化由于依替米星极性大,在ODS柱上不保留,需要通过与挥发性酸形成离子对或采用碱性流动相使氨基糖甙类抗生素游离成碱,降低极性以增加在色谱柱上的保留。中国药典收载方法采用0.2mol/L三氟乙酸-甲醇（84:16）为流动相，因为三氟乙酸是较强的离子对试剂，不适合电喷雾离子化的质谱分析，本文在相关文献的启发下3，采用宽pH范围色谱柱，在碱性条件下建立了适合HPLC-ELSD-ESI-MSn分析的色谱条件，该条件下，依替米星与合成原料、其他可能的杂质、降解产物均能有效分离。由于依替米星无紫外和紫外末端吸收，无法采用紫外检测器，采用蒸发光散射检测器进行检测，作者在使用手册推荐的条件基础上对ELSD的测定条件进行了优化，并综合考虑仪器的信噪比，确定ELSD测定条件为：漂移管温度105、载气流量2.6L/min。3.2 方法的验证3.2.1 方法专属性实验 与合成原料、中间体及其他杂质的分离 分别取硫酸依替米星、合成原料庆大霉素C1a、中间体P1、庆大霉素C组分各适量,加水制成溶液进样。结果表明，依替米星和上述各杂质之间有较好的分离度(见图1)。图1 硫酸依替米星和相关杂质的色谱分离图1 硫酸根；2 庆大霉素C1a；3 中间体P1；4、5、6为庆大霉素C组分中的另外3组分；7.依替米星 分解产物的分离 分别取硫酸依替米星适量,分别用氨水、冰醋酸，以及30%的双氧水溶解并制成约10mg/ml的溶液，与沸水浴中放置3h，取出放冷至室温，加水稀释成1mg/ml的溶液后进样，结果显示，分解产物均能与依替米星有效分离。1 硫酸根；2 酸降解物；3.依替米星1 硫酸根；2.依替米星1 硫酸根；2 氧化破坏产物；3.依替米星图2 硫酸依替米星和分解产物的色谱分离图（ a. 酸破坏；b. 碱破坏；c.氧化破坏）3.2.2 线性关系及检出限精密称取依替米星对照品适量,加水制成含依替米星1.0173，0.6782，0.5087，0.2543，0.2035，0.1017，0.05086g/L的溶液,进样后，以依替米星峰峰面积的对数（logA）和相应溶液浓度的对数（logC）计算出回归方程，结果见表1。根据信噪比S /N = 3,测得最低检出浓度,结果见表1。表1 回归方程、相关系数及检测限线性范围( g/L)回归方程相关系数检出限(mg/L)0.050861.0173LogA1.4103logC+6.68530.9998103.2.3 重复性实验精密称取同一批号硫酸依替米星6份，按含量测定方法测定，含量结果RSD=1.8%。3.2.4 样品有关物质和含量测定取本品3批,按2. 2. 1项下的色谱条件,进样测定,080103、080104、080105批含量（以依替米星计）分别为59.9%、56.8%、57.4%，最大单个杂质含量均小于1.0%,总杂质含量均小于2.0%。3.3 依替米星中有关物质的结构解析按2.2.1和2.2.2条件，利用HPLC-ESI-MSn，采用全扫描一级质谱( Full scan)和离子全扫描二级质谱( Full scanMS2 ) 2种方式对样品进行检测，测定结果见图4和表3，样品中约有18个有关物质峰。因依替米星(etimicin)是以庆大霉素C1a为起始原料合成得到氨基糖苷类抗生素，用离子交换大孔树脂进行纯化，某些结构相似的杂质在纯化过程中可能与依替米星共吸附于树脂上而残留在成品中，成品放置过程中也会有部分降解物产生，所以样品中的有关物质可能为(1)合成的起始原料或该原料中的杂质、(2)中间体或副产物、（3）放置过程中形成的降解产物，可见，本品中的有关物质与主成分依替米星在分子结构上应该有内在的联系，二者质谱裂解途径也会有相似的规律；根据这个思路，通过解析主成分依替米星的二级质谱裂解途径，归纳依替米星的裂解规律，在此规律的基础上，根据关物质的一级质谱推测其分子结构，再根据推测的结构解释各二级质谱碎片离子，如碎片离子均能得到合理解释，认为推测结果合理，必要时，用杂质对照品验证推测的合理性，即采用比较有关物质与对照品的色谱保留时间、一级质谱和二级质谱进行结构确证。图4. 依替米星样品的LC-MS（TIC）分析图谱根据色谱出峰先后顺序对各色谱峰按英文字母进行编号，对应的有关物质按编号顺序进行命名（如A峰的有关物质称为有关物质A，当同一色谱峰包含有多个物质时，按m/z 由小到大进行命名，如N色谱峰包含2个物质，m/z378命名为有关物质N1，m/z479命名为有关物质N2）表2 依替米星及其有关物质HPLC-ESI-MS/MS的分析结果色谱峰代号名称（缩写）保留时间（min）M+H+二级质谱主要碎片离子A未知2.1497338,321,380,480,363 ,176,163B依替米星降解物1（ETM-deg1）2.5319191C庆大霉素C1a(GTMC1a)3.2450322,163,291,205,160,433D依替米星降解物2(ETM-deg2)3.5350233,191,160E小诺霉素同分异构体1(MCR-1)3.7464336,233,191,163F小诺霉素同分异构体2(MCR-2)4.4464336,174,291G小诺霉素(MCR)4.8464322,163,305,205,160,447H未知5.2459噪音大，无法提取I未知5.9503503,472,344,326,200,170J小诺霉素同分异构体3(MCR-3)6.4464336,174,291K依替米星同分异构体1(ETM-1)7.4478322,461,160, 163,205L未知8.9混合物峰-M依替米星同分异构体2(ETM-2)10.5478350,191,319,233,160,461N依替米星同分异构体(未知)12.2478350,322,291,188,163,447O依替米星(ETM)13.9478350,191,319,233,160,461P未知（结构确定）19.0378261,219,174未知（结构确定）479462,350,320,233,191,160Q依替米星同系物1(ETM-der1)24.7492350, 191, 333 ,475, 160R依替米星同系物2(ETM-der2)28.8492364, 191, 319 , 475,174,4293.3.1、依替米星二级质谱裂解规律的总结依替米星分子结构如图5所示，由绛红糖胺、2-脱氧链霉胺、加洛糖胺三部分以糖苷键连接，它们的二级质谱如图6所示，裂解途径见图7。图5 依替米星分子结构图6. 依替米星的二级质谱图7. 依替米星二级质谱裂解途径 对依替米星二级质谱裂解途径分析发现其有如下裂解规律： (1)糖苷键的i裂解：分子中两糖苷键均可断裂，分别脱去A环或C环，生成碎片离子m/z350和m/z319，或同时脱去A环和C环，产生碎片离子m/z191，二级质谱中m/z350为基峰，表明连接A、B环的糖苷键更易断裂。(2)开环裂解或开环并重排裂解：m/z233是由m/z350通过C环开环裂解形成；m/z160是通过分子在B、C环糖苷键处并发生氢重排形成C环脱氢的碎片离子。(3) 支链裂解不易发生：三组分均除检测到强度极弱的脱氨碎片离子m/z461外，其余支链裂解碎片离子均未发现。3.3.2、依替米星（M+H+m/z478）及其同分异构体结构解析依替米星样品中检测到四个M+H+m/z478组分，其中，tR=13.9min处为依替米星色谱峰，其余三个为有关物质，即有关物质K、M、N，各色谱峰的保留时间、二级质谱碎片离子等信息如表3所示。 有关物质M与依替米星的一级质谱和二级质谱完全相同，M+H+均为478，二级质谱均为350, 191, 319, 233, 160, 461，但色谱保留不同(tM=10.5min，t依替米星=13.9min)，显然为同分异构体，其中m/z 350应为丢失A环形成的离子，m/z 319应为丢失C环形成的离子，m/z 191应为同时丢失A、C环形成的离子，表明有关物质M与依替米星的结构差异只能在B环上，而依替米星B环上只有1位氨基上的乙基可以替换到3位氨基上的一种可能，由此可以确定有关物质M的结构，按推测的分子结构归属碎片离子，均能得到合理解释，表明该推测合理。有关物质K(tR=7.4min)的二级质谱碎片离子为322,461,160,163,205,其中 m/z322离子应为B环上1位氨基取代基R1为H时，分子脱去A环产生的离子，m/z163、m/z205可印证该推测合理，根据M+H+m/z478可知，只有当A环的某个氨基上的氢被乙基取代后，其余的碎片离子才能合理解释，但根据现有的二级质谱数据还无法准确推断该乙基应与那一个氨基连接，根据合成工艺的反应机理可知，只有当庆大霉素C1a有立体异构体时，使得B环1位氨基无法与醋酸钴络合得不到保护，而A环上的某个氨基恰好被络合，从空间结构上分析发现只有2位氨基具有这种可能性4，因此可推知有关物质K的化学结构如图8中结构。对tR=12.1min色谱峰(有关物质N)质谱分析显示，该峰不同时间点的二级质谱碎片离子丰度比有明显差异，显示该色谱峰为m/z相同的多组分峰，用质谱无法区别，需要通过改变分离条件实现色谱分离后，再通过质谱分析确定结构。R1R2R3依替米星(ETM)C2H5HH有关物质M同分异构体1(ETM-1)HHC2H5有关物质K同分异构体2(ETM-2)HC2H5H图8. 依替米星及其同分异构体可能的化学结构图9. 有关物质M（tR=10.5min）的二级质谱裂解途径图10. 有关物质K（tR=7.4min）的二级质谱裂解途径3.3.3、小诺霉素(M+H+m/z464)及其同分异构体结构解析依替米星样品中检测到四个M+H+m/z464组分，即有关物质E、F、G、J，各色谱峰的保留时间、二级质谱碎片离子等信息如表3所示。其中，有关物质G（tR=4.8min）与小诺霉素（tR=4.8min）的色谱保留时间一致，一级、二级质谱也完全相同，表明有关物质G为小诺霉素。R1R2R3有关物质E小诺霉素同分异构体1(MCR-1)C2H5HH有关物质F小诺霉素同分异构体2(MCR-2)HCH3CH3有关物质G小诺霉素 (MCR)CH3CH3H有关物质J小诺霉素同分异构体3(MCR-3)HC2H5H图11. 小诺霉素及其同分异构体可能的化学结构有关物质E(tR=3.8min)的碎片离子m/z191,233, 319,163与依替米星的大部碎片相同，根据前述分析的规律可知，该有关物质的A、B环结构与依替米星的相同；m/z336比依替米星的m/z350少14，表明该有关物质的C环上比依替米星的C环少一个甲基，推测其结构应如图11所示，二级质谱碎片裂解途径如图12所示，均得到合理解释。图12. 小诺霉素同分异构体MCR-1（tR=3.8min）的二级质谱裂解途径有关物质F(tR=4.4min)、有关物质J（tR=6.4min）的二级质谱完全相同，均为m/z336, 174, 291，二者应为结构极其相似的同分异构体，根据二级质谱推测二者化学结构应如图12所示，对碎片离子裂解途径分别如图13、图14所示，均得到合理解释，但对二者的结构确证需要用其他手段进一步研究。图13. 小诺霉素同分异构体MCR-2（tR=4.4min/or6.4min）的二级质谱裂解途径图14. 小诺霉素同分异构体MCR-3（tR=6.4min or 4.4min）的二级质谱裂解途径3.3.4、依替米星同系物(M+H+m/z492)结构解析有关物质Q( tR=24.7min)、有关物质R(tR=28.8min)的M+H+m/z均为492，有关物质Q的二级质谱碎片离子为m/z350, 191, 333 ,475, 160，其中m/z350,191,160与依替米星部分碎片离子相同，推测其结构中B、C环与依替米星相同，m/z333比依替米星中m/z319多14，推测其A环比依替米星的A环多一个甲基；有关物质R的二级质谱碎片离子为m/z364, 191, 319 , 475,174,429，由m/z319、191推测其结构中A、B环与依替米星相同，由m/z364、191、174推测C环上比依替米星的C环增加一个甲基;根据上述分析，两有关物质为依替米星同系物，可能的结构如图15所示，按推测的分子结构归属碎片离子，均能得到合理解释（图15、16），表明该推测合理。R1R2依替米星同系物1(ETM-der1)HCH3依替米星同系物2(ETM-der2)CH3H图15. 依替米星同系物可能的化学结构图16.有关物质Q（tR=24.7min）的二级质谱裂解途径图17.有关物质R（tR=28.8min）的二级质谱裂解途径3.3.5、依替米星降解产物的结构确证 有关物质B( tR=2.5min)、有关物质D(tR=3.5min)的 M+H+m/z分别为319和350，推测可能为依替米星分别脱去A环和C环的降解产物，降解途径如图18所示，M+H+m/z 319的MS2碎片离子主要为m/z191; M+H+m/z 350的MS2碎片离子主要为m/z 233,191,160,按推测的分子结构归属碎片离子，均能得到合理解释（图19、20），表明该推测合理。图18. 依替米星可能的降解途径图19. 有关物质B(tR=2.5min)二级质谱裂解途径图20. 有关物质D(tR=3.5min)二级质谱裂解途径3.3.6、合成原料庆大霉素C1a的结构确证有关物质C的M+H+为m/z450，表明其分子量为449，与依替米星合成用原料庆大霉素C1a的分子量(MW 449)相同，提示有关物质C可能为庆大霉素C1a；有关物质C二级质谱碎片离子分别为m/z322,163,291,205,160,433，按庆大霉素C1a的结构解析各碎片离子，均得到和理解释，表明有关物质C ( tR=3.2min) 为庆大霉素C1a。作者还将庆大霉素C1a标准品配制成溶液，按样品有关物质测定用的色谱和质谱条件进行检测，结果显示，有关物质C与庆大霉素C1a的色谱保留时间、一级质谱及二级质谱完全一致，证明上述鉴定结果正确，也证明了用二级质谱鉴定物质结构的可靠性。3.3.7、其他有关物质的结构确证tR=19.0min色谱峰中包含两个组分，即有关物质P1（m/z378）和有关物质P2(m/z479)。有关物质P1（m/z378）二级质谱为219,261,174, 160，m/z219比依替米星二级质谱碎片离子m/z191多28，推测B环上比依替米星多乙基，m/z160推测其C环应与依替米星的C环相同，由此推测其结构如图21 a所示。有关物质P2的二级质谱碎片离子为m/z350,191,320,233, 160,462,与依替米星的二级质谱(350, 191,319,233, 160,461)极其相似;由m/z350,191,233,160推测有关物