马兜铃酸_脱氧核糖核酸加合物的质谱分析.pdf

马兜铃酸 2 脱氧核糖核酸加合物的质谱分析 季文萱 1 杨成对 2 刘密新 2 谌贻璞 31 1 中日友好医院 北京100029 2 清华大学分析测试中心 北京100084 摘 要 马兜铃酸 aristolochic acid AA 经酶活化法 黄嘌呤氧化酶法 和化学活化法 锌法 活化后与脱氧 腺苷酸在弱酸环境下反应合成了AA2DNA加合物 采用多种质谱技术对加合物进行了鉴定 电喷雾 2 质谱法 ESI 2 MS 负离子采集模式下测得其准分子离子峰分别为m z621和591 利用多级串联质谱 MS n 等方法 得 到了加合物的结构信息 应用傅里叶变换离子回旋共振质谱 FT 2ICRMS 精确质量数测定和同位素模式检测 进一步确认了目标化合物 结果表明 质谱法分析AA2DNA加合物方便 准确 可靠 优于国外文献报道的 32 P2 后标记法 关键词 马兜铃酸 脱氧核糖核酸加合物 合成 液相色谱 2 串联质谱法 傅里叶变换离子回旋共振质谱法 2007210223收稿 2008201205接受 本文系卫生部属 管 医疗机构临床学科重点资助项目 2005 2007年度 3E2mail chen yipu medmail edu cn 现工作于青岛市中习医院肾内科 1 引 言 马兜铃酸 aristolochic acid AA 是马兜铃科 aristolochiaceae 马兜铃属 aristolochia 植物所含的成 分 含有AA成分的中药曾在国内外被用来治疗多种疾病 后被发现致突变 致肿瘤和肾毒性等而引起 国内外学者广泛关注 1 多项短期体内和体外实验均发现 AA致癌性 2 3 服用含 AA的中草药引起 的马兜铃酸肾病 aristolochic acid nephropathy AAN 在国内发病率仍较高 其中一部分病人可并发泌尿 系统癌症 甚至在肾移植后仍可发生泌尿系统肿瘤 4 多项研究认为具有特异性的 AA2DNA加合物是 上述肿瘤发生的重要原因 5 7 李伟等 8 用 LC2MS检测马兜铃酸 刘养清等 9 用 HPLC测定了中药配 伍中的马兜铃酸 鉴于AA2DNA加合物在体内含量极微 加之体外制备时反应条件要求苛刻 反应产率非常低以及 纯化非常困难 目前尚无AA2DNA加合物的标准品 且尚无理想的直接标记方法 检测困难 目前国外 常用的检测AA2DNA加合物的方法为 32 P2 后标记法 但其缺点是步骤较繁琐 不能提供加合物结构信 息 稳定性差 不同实验室检测结果差异很大等 因此有必要建立一种方便 快捷 准确的结构分析与鉴定 AA2DNA加合物的新方法 有研究将质谱技术用于检测DNA加合物 10 国外有个别报道质谱用于检测 AA2DNA加合物 11 但迄今为止 进行高可靠性确认AA2DNA加合物的多级质谱分析及利用傅里叶变换 离子回旋共振质谱法进行精确质量和同位素丰度测定尚未见报道 本研究通过体外合成AA2DNA加合 物 优化反应条件 利用线性离子阱多级质谱和傅里叶变换离子回旋共振质谱对AA2DNA加合物进行分 析研究 建立了相应质谱鉴定方法 这对于进一步研究其生物化学特性和生物学行为特征很有意义 2 实验部分 2 1 仪器与试剂 LTQ高效液相色谱 2 电喷雾线性离子阱质谱联用仪 美国Thermo Electron公司 色谱柱为C18液相 色谱柱 250 mm 4 6 mm 5 m 美国Agilent公司 数据采集及处理软件使用Xcalibur T M 1 4 SR1 9 4TQ2FT2ICR2MS Apex Qe超高性能混合型四极杆串联傅里叶变换离子回旋共振质谱仪 德国Bruker 公司 配置电喷雾离子源 厌氧指示剂试纸 Anaerotest strips 德国Merck公司 马兜铃酸钠盐 aristolochic acid sodium salt AA2Na AA 2Na 45 AA 2Na 52 2 2 脱氧腺苷5 2 磷酸 2 2deoxyadenosine 5 2monophosphate dAp 98 100 黄嘌呤氧化酶 xanthine oxidase from but2 ter milk 1 1 3 22 和次黄嘌呤 hypoxanthine 99 美国 Sigma公司 第36卷 2008年7月 分析化学 FENXIHUAXUE 研究报告 Chinese Journal ofAnalytical Chemistry 第7期 930 934 2 2 实验方法 2 2 1 DNA加合物的合成 AA代谢活化途径与AA2DNA加合物反应途径见图1 图1 马兜铃酸代谢活化途径和AA2DNA加合物结构图 Fig 1 Metabolic activation and DNA adduct formation of aristolochic acid AA 酶活化法 准确称取4 mol dAp 1 mol次黄嘌呤和2 mol AA2Na分别加至1 mL 50 mmol L K3PO4缓冲液 pH 5 8 中混匀 除氧15 min后加入1U黄嘌呤氧化酶 继续除氧30 min后密封 使用 厌氧指示剂试纸条监测除氧及无氧状态维持效果 化学活化法 称取4 mol dAp 2 mol AA2Na及 5 mg锌粉分别加至1 mL 50 mmol L K3PO4缓冲液 pH 5 8 中混匀 空白对照组不加入AA2Na或dAp 或活化体系 反应体系分别避光37 恒温震荡12 h后 4 终止反应 反应液经冷冻干燥 以流动相 重新溶解 经离心过滤后检测 2 2 2 分析方法及分析条件 ESI2MS条件 负离子采集模式 甲醇为流动相 流速300 L min 进样量 为20 L 离子源喷射电压4 0 kV 毛细管电压 7 0 V 毛细管温度275 氮气为鞘气 流速30 arb 用ESI2MS n 方式获得待测物的结构信息 ESI2MS n条件 MS n 碰撞气体为氦气 优化的多级质谱相对碰撞 能量为20 30单位 优化程序由Xcalibur T M软件完成 利用超高性能9 4T混合型四极杆串联傅里叶变换离子回旋共振质谱仪精确测定待测物的分子量 和分子离子峰的同位素比 实验条件 负离子采集模式 流动相为100 甲醇 注射泵流速90 L h 离 子源喷射电压3 9 kV 毛细管电压4 4 kV 干燥气流速4 0 L min 加热器温度180 C 磁场强度9 4 T 3 结果与讨论 3 1 dAp2AA电喷雾质谱特征及鉴定 AA有两种异构体AA 和AA dAp2AA 分子式为C27H23O10N6P 分子量为622 dAp2AA 分子 式为C26H21O9N6P 分子量为592 5 6 该类化合物很容易失去一个质子产生 M H 离子 在ESI2MS 图2 dAp2AA 和dAp2AA 的一级质谱图 Fig 2 ESI2MS spectrum of 2 2deoxyadenosine 5 2mono2 phosphate dAp 2AA and dAp2AA 负离子采集模式下信号响应较强 dAp2AA 和 dAp2AA 的负离子一级质谱图见图2 图中显示有 较强的m z621和591峰 m z621离子对应dAp2 AA 的 M H m z591离子对应dAp2AA 的 M H 由图2可以初步确定dAp2AA 和dAp2 AA 的存在 3 2 dAp2AA的多级质谱分析及结构鉴定 dAp2AA 的多级质谱图见图3 选择m z621 为母离子 主要产生m z分别为577 509 425 393 330及195等一系列子离子 图3 a 信号较强的 m z425离子为 M H 离子从糖苷键处断裂丢失 脱氧核糖和磷酸 C 5H9O6 P 后马兜铃内酰胺 aristolactam AL 和腺嘌呤形成 脱氧核糖和磷酸 形成m z195离子 AL 与dAp共价键连接处断裂后 dAp形成m z330离子 图 4 为了详细研究这类加合物的质谱裂解规律 进一步确认其结构 本研究还利用线性离子阱多级质谱 139 第7期季文萱等 马兜铃酸 2 脱氧核糖核酸加合物的质谱分析 图3 dAp2AA 的多级质谱图 Fig 3 ESI2MSnspectrum of M H ions of dAp2AA a dAp2AA 的二级质谱图 MS 2 spectrum of M H atm z621 b 三级质谱图 选择m z425为母离子 MS 3 spectrum of M H 196 atm z425 c 四级质谱图 选择m z393为母离子 MS 4 spectrum of M H 196 CH3OH atm z 393 d 五级质谱图 选择m z365为母离子 MS 5 spectrum of M H 196 CH3OH CO atm z365 e 六级质谱 图 选择m z337为母离子 MS 6 spectrum of M H 196 CH3OH CO CO atm z337 f dAp AA 的三级质谱 图 选择m z330为母离子 MS 3 spectrum of M H AL atm z330 g dAp AA 的三级质谱图 选择m z195为 母离子 MS 3 spectrum of M H AL A atm z 195 图4 dAp2AA M H 离子可能的裂解途径 Fig 4 Proposed fragmentation pathways of dAp2AA 分析功能 分别选择上述离子进行了MS n 谱分析 m z425离子MS 3 谱图显示其脱去一分子甲醇 CH 3OH 形成具有特征的m z393离子 图 3b 后 者脱去一分子CO形成m z365离子 图 3c m z 365离子的MS 5 谱图提示其容易再脱去一分子CO形 成m z337离子 图3d 后者可继续脱去一分子CO 形成m z309离子 再脱去NH形成m z294离子 图 3e 本研究还选择具有特征性的m z330离子和 m z195离子进行了MS 3 谱分析 m z330离子主要 产生m z195 177 134等碎片离子 m z195为m z 330离子脱去腺嘌呤形成 继续脱去一分子水形成m z177离子 腺嘌呤则形成m z 134 图 3f m z 195主要产生m z177 97和79等碎片离子 其脱去一分子水形成m z177离子 脱去一分子磷酸或脱 去脱氧核糖均可形成m z97离子 后两者分别脱去一分子水均形成m z79离子 图 3g m z330和 195离子两者的MS 3 谱碎片离子分别与原料dApm z330离子的 ESI2MS 2 谱及m z330 195离子 的 ESI2MS 3 谱完全一致 证实了上述推测的二级质谱的裂解途径 所有空白对照组质谱图均无上 述特征 上述多级质谱图充分证实了合成产物与文献报道dAp2AA 结构一致 dAp2AA 的MS n 谱图见图5 选择m z591为母离子 主要产生m z分别为546 502 395 330及 195等一系列子离子 图 5a 与dAp2AA 相似 信号较强的m z395离子为m z591离子由糖苷键处 断裂后AL 和腺嘌呤所形成 磷酸和脱氧核糖则形成m z195离子 m z591离子脱去AL 的OCNH 形成m z546离子 继续脱去一分子CO2形成m z502离子 与dAp2AA 相同 m z330离子为m z 591离子脱去AL 后dAp所形成 图 6 选择特征的m z395离子研究其结构 其MS 3 谱显示产生m z367和324离子 前者由m z395离 子脱去一分子CO形成 继续脱去AL 的OCNH形成后者 图 5b 选择m z367离子进行四级质谱检 测 与三级质谱裂解规律相同 图 5c 与dAp2AA 相同 m z330离子的三级 四级质谱图谱分别与原 料dAp的二级 三级质谱图谱完全相同 图5d e 证实了所合成的dAp2AA 结构与文献完全相符 3 3 傅里叶变换离子回旋共振质谱图及分子式鉴定 图7和图8分别是dAp2AA dAp2AA 的FT2ICRMS负离子采集模式下超高分辨质谱图 A 和同 239 分 析 化 学第36卷 图5 dAp2AA 的多级质谱图 Fig 5 ESI2MS 2 spectrum of M H ions of dAp2AA a dAp2AA 的二级质谱图 MS 2 spectrum of M H atm z591 b 三级质谱图 选择m z395为母离子 MS 3 spectrum of M H 196 at 395 c 四级质谱图 选择m z367为母离子 MS 4 spectrum of M H 196 CO at m z367 d dAp2AA 的三级质谱图 选择m z330为母离子 MS 3 spectrum of M H AL atm z330 e dAp2AA 的三级质谱图 选择m z195为母离子 MS 3 spectrum of M H AL A atm z 195 图6 dAp2AA M H 离子可能的裂解途径 Fig 6 Proposed fragmentation pathways of dAp2AA 位素模式 B 图 表1为加合物的超高分辨质谱数据 汇总 显示目标产物测量值 仪器软件给出的分子式及 理论计算值 质量测量误差均小于1 5 10 6 2种加 合物同位素峰簇及其相对丰度均与实测峰值分别一致 FT2ICRMS超高分辨质谱检测数据进一步证实了所得产 物即所要合成的加合物 综上所述 实验对2种AA2DNA加合物在3个不同 层次进行了质谱研究 利用全扫描质谱法显示的准分子 离子峰获得了分子量 分别为622和592 利用多级质 谱法获得了结构信息 主要有m z577 509 425 393 图7 dAp2AA 的FT2ICRMS一级质谱图 A 和同位 素模式图 B Fig 7 Fourier transform2ion cyclotron resonance FT2 I CR ESI2MS spectrum A and isotope pattern spectrum B of dAp2AA 图8 dAp2AA 的FT2I CRMS一级质谱图 A 和同位 素模式图 B Fig 8 FT2ICR ESI2MS spectrum A and isotope pattern spectrum B of dAp2AA 546 502 395 330及195等 利用傅里叶变换离子回旋共振质谱法提供的精确质量和同位素比确定了 分子式和分子量 本方法与传统的 32 P2 后标记法相比 不但具有快速 简便 灵敏度高 样品用量少 重 表1 DNA加合物的超高分辨质谱检测信息 Table 1 Data of ultra high resolution mass spectrum and corresponding structural formula ofDNA adducts 化合物 Compound 化学式 Mol Formula 测量值Measured M H m z 计算值Calculated M H m z 质量测量误差Error mDa 10 6 dAp2AA C27H23O10N6P621 11458621 11405 0 690 9 dAp2AA C26H21O9N6P591 10414591 10349 0 661 1 339 第7期季文萱等 马兜铃酸 2 脱氧核糖核酸加合物的质谱分析 现性好 准确可靠和无需放射防护等优点 最重要的是能够提供丰富的结构信息 与文献报道的仅用 一 二级质谱法分析AA2DNA的方法相比 本方法的鉴定可靠性显著提高 有望成为新型高效的AA2 DNA加合物检测手段 致 谢 本工作承中国科学院化学所王光辉研究员指导和帮助 谨谢 References 1 Chen Yi2Pu 谌贻璞 J Clin Intern M ed 临床内科杂志 2003 20 4 174 175 2 ArltV M StiborovaM Schmeiser H H M utagenesis 2002 17 4 265 277 3 Cosyns J P D rug Safety 2003 26 1 33 48 4 ChenWen 陈 文 Chen Yi2Pu 谌贻璞 LiAn 李 安 Chin J Nephrol 中华肾脏病杂志 2004 20 15 17 5 StiborovaM Frei E SopkoB Sopkova K MarkovaV LankovaM Kumstyrova T W iesslerM SchmeiserH H Carcino2 genesis 2003 24 10 1695 1703 6 StiborovaM Frei E Hodek P W iesslerM Schmeiser H H Int J Cancer 2005 113 2 189 197 7 MeiN ArltV M PhillipsD H Heflich R H Chen T M utat Res2Fund M ol M 2006 602 83 91 8 LiWei 李 伟 Han Jian2Ping 韩建平 Gao Jun 高 钧 Liu Chang2Xiao 刘昌孝 Chinese J Anal Chem 分析化学 2007 35 12 1798 1800 9 Liu Yang2Qing 刘养清 Zhao Hui2Hui 赵慧辉 Hou Na 侯 娜 Zhao Ping 赵 平 Chinese J Anal Chem 分析化学 2006 34 s161 s164 10 DennehyM K Loeppky R N Chem Res Toxicol 2005 18 6 1048 1055 11 ChanW Zheng Y Cai Z J Am Soc M ass Spectrom 2007 18 4 642 650 Mass Spectrometric Analysis for Aristolochic Acid2 Deoxyribonucleic Acid Adducts J IWen2Xuan1 YANG Cheng2Dui 2 L I U Mi2Xin2 CHEN Yi2Pu3 1 1 China2Japan Friendship Hospital Beijing 100029 2 Analysis Center Tsinghua University Beijing100084 Abstract Aristolochic acid AA was incubated with 2 2deoxyadenosine 5 2monophosphate dAp in mild acid phosphate buffer in vitro for 12 hours using either enzymatic activation by xanthine oxidase or chemi2 cal activation by zinc to synthesize AA2DNA adducts and the solventswere evaporated under vacuum The AA2DNA adductswere characterized by multiple mass spectrometric techniques Electrospray ionization tan2 dem mass spectrometry ESI2MS MS was used for the characterization of the AA2DNA adducts Full scan spectra were obtained in the negative ion mode and the quasi2molecular ion peaks of the AA2DNA