现代生化技术思考题答案(仅供参考).doc

现代生化技术课程思考题绪论1、简述生化技术的定义和主要内容。生化技术：是生物化学及其相关学科应用的各种技术。主要是指生物体内物质及代谢产物，特别是生物大分子的分离、制备、检测及改造技术。它是一门理论与实践（验）相结合的专业技术基础课。 主要内容包括：生物大分子的分离、纯化及制备；生物体内物质及代谢产物定量和定性检测；以及生物改造技术（肽、DNA合成等）。第一章 提取与沉淀分离技术u 溶涨现象：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。例如红血球置清水中会迅速溶胀破裂并释放出血红素。u 自溶现象：细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解的现象称自溶。u 抽提：抽提通常是指用适当的溶剂和方法从原材料中把有效成分分离出来的过程。u 盐析：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。u 等电沉淀：利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。u 有机溶剂沉淀：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。 1、 细胞破碎方法可分为哪些类型？简述细胞破碎的意义。u 酶学破碎法：外加酶制剂、自溶法。u 机械破碎法：高速捣碎法、高速均浆法、高速磨珠法u 物理破碎法：温差法、压差法、超声波u 化学破碎法：有机溶剂法、表面活性剂（SDS 等）、金属螯合剂（Mg2+、Ca2+、EDTA）、化学变性剂。2、 何谓抽提？影响抽提的主要因素有哪些？u 抽提通常是指用适当的溶剂和方法从原材料中把有效成分分离出来的过程。u 一般理想的抽提液应具备下述条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质不溶解或溶解度很小；来源广泛、价格低廉、操作安全等。u pH值：改变溶质解离状态。对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，一般选择抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内。通常碱性蛋白质选用低pH值的溶液抽提，酸性蛋白质选用高pH值的溶液抽提，或者用调至一定pH值的有机溶剂抽提。 u 溶剂的极性和离子强度：有些生物大分子在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。一种物质溶解度大小与溶剂性质密切相关（相似相溶原理）；离子强度通过影响溶质的带电性也影响溶质的溶解度。降低极性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亚砜，二甲基甲酰氨。提高离子强度：在水溶液中加中性盐（KCl, NaCl, NH4Cl, (NH4)2SO4）u 水解酶：细胞破裂后，许多水解酶释放出来。水解酶与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。为此，必须采用加入抑制剂，调节抽提液的pH、离子浓度或极性等方法，使这些酶丧失活性。u 温度：一般认为蛋白质或酶制品在低温(如0左右)时最稳定。 u 搅拌：搅拌能促使欲抽提物与抽提液的接触，并能增加溶解度。但是，一般宜采用温和的搅拌方法 ，速度太快时容易产生泡沫，导致某些酶类变性失活。u 氧化：一般蛋白质都含相当数量的巯基，该基团常常是酶和蛋白质的必须基团，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶(或蛋白质)失活(或变性)。在提取液中加入巯基乙醇，半胱氨酸。还原性谷胱甘肽等还原剂，可防止巯基发生氧化，使蛋白，酶失活。u 金属离子：蛋白质的巯基除易受氧化剂作用外，还能和金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。 这些金属离子主要来源于制备缓冲液的试剂中。解决的办法：用无离子水或重蒸水配制试剂；在配制的试剂中加入1-3mmol/L的EDTA(金属离子络合剂)。 u 抽提液与抽提物的比例：在抽提时，抽提液与抽提物的比例要适当，一般以51为宜。如抽提液过多，则有利于有效成分的提取，但不利于纯化工序的进行。3、 何谓盐析？其工作原理是什么？影响盐析的主要因素有哪些？u 定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。u 原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。4、 常用的蛋白质沉淀方法有哪些？盐析操作时常用的盐有哪些？蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵。 硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用。又因为其离子容积较大，吸走水分子的能力也大，成为有效的盐析工具。硫酸铵在水中的溶解度大而温度的影响小( 25时溶解度为4.1mo l/L，即767g/L;0时溶解度为3.7mol/L，即697g/L)，而且价廉易得，不易引起蛋白质变性，分离效果比其他盐好。5、 有机溶剂沉析法的原理是什么？影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？作用机理： （1）降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低； （2）破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。6、 简述等电点沉析的原理。在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。7、 常用的核酸物质沉淀分离技术有哪些？u 有机溶剂沉淀法u 等电点沉淀法u 钙盐沉淀法u 选择性溶剂沉淀法第二章 过滤与膜分离技术过滤：是借助过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程膜过滤：大部分微滤以及超滤、反渗透、透析、电渗析等采用各种高分子膜为过滤介质，称为膜过滤。膜分离技术：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。超滤：反渗滤 ：过程类似于超滤，只是纯溶剂通过膜，而低分子量的化合物被截留。因此，操作压力比超滤大得多。 因此，超滤和反渗透通常又被称之为“强制膜分离过程”1、 何谓过滤？过滤的基本形式有哪些？指借助过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。按介质来分：有非膜过滤和膜过滤;其中非膜过滤可以分1.粗滤、根据动力的不同可以分为常压过滤，加压过滤，减压过滤；2、微滤膜分离，1加压膜分离，按照颗粒的大小又分为微滤，超滤，反渗透3种；2电场膜分离，又可分为电渗透，离子交换膜电渗透，3扩散膜分离等。膜过滤可以分为2、 何谓膜分离技术？膜分离技术有哪几种形式？u 膜分离的概念：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。膜分离，1加压膜分离，按照颗粒的大小又分为微滤，超滤，反渗透3种；2电场膜分离，又可分为电渗透，离子交换膜电渗透，3扩散膜分离等。3、 根据膜孔径大小，膜分离技术可分为哪几类？u 膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔径大小而达到物质分离的目的，故而可以按分离粒子大小进行分类：微滤（MF）：以多孔细小薄膜为过滤介质，压力差为推动力，使不溶性物质得以分离的操作，孔径分布范围在0.02514m之间；超滤（UF）：分离介质同上，但孔径更小，为0.0010.02 m，分离推动力仍为压力差，适合于分离酶、蛋白质等生物大分子物质；反渗透（RO）：是一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作，孔径范围在0.00010.001 m之间；（由于分离的溶剂分子往往很小，不能忽略渗透压的作用，故而成为反渗透）；纳滤：以压力差为推动力，从溶液中分离3001000小分子量的膜分离过程，孔径分布在平均2nm；电渗析：以电位差为推动力，利用离子交换膜的选择透过性，从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作；4、 何谓反渗透？在超滤和反渗透过程中渗透压有什么样的影响？u 过程类似于超滤，只是纯溶剂通过膜，而低分子量的化合物被截留。因此，操作压力比超滤大得多。因此，超滤和反渗透通常又被称之为“强制膜分离过程”u 超滤：需要增加流体的静压力，改变天然过程的方向，才可能发生含有低分子量化合物的溶剂流通过膜，此时的推动力是流体静压力与渗透压的压差；5、 常用的膜分离组件有哪些？u 平板式膜组件u 管式膜组件u 中空纤维（超滤）膜组件u 螺旋卷绕式膜组件6、 何谓反渗透膜分离过程？其特点有哪些？u 是一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作，孔径范围在0.00010.001 m之间；（由于分离的溶剂分子往往很小，不能忽略渗透压的作用，故而成为反渗透）；7、 简述亲和膜分离技术的工作原理。亲和膜分离：制备带有亲和配基的分离膜，直接进行产物分离；8、 简述电渗析膜分离的工作原理电渗析技术是在直流电场的作用下，由于离子交换膜的阻隔作用，实现溶液的淡化和浓缩，分离推动力是静电引力。以电位差为推动力，利用离子交换膜的选择透过性，从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作；第三章 萃取分离技术萃取：利用在两个互不相溶的液相中各种组分（包括目的产物）溶解度的不同，从而达到分离的目的超临界萃取：双水相萃取：是利用物质在不相溶的，两水相间分配系数的差异进行萃取的方法1、 什么是萃取过程？2、 液液萃取从机理上分析可分为哪几类？3、 常见物理萃取体系由那些构成要素？ 溶质：被萃取的物质 原溶剂：原先溶解溶质的溶剂 萃取剂：加入的第三组分4、 何谓萃取的分配系数？其影响因素有哪些？衡量萃取体系是否合理的重要参数：y-平衡时溶质在轻相中的浓度x-平衡时溶质在重相中的浓度 分配系数的对数值与标准状态下的化学势的差值有关5、 何谓超临界流体萃取？其特点有哪些？u 原理：超临界流体具有选择性溶解物质的能力，并随着临界条件（T，P）而变化。超临界流体可从混合物中有选择地溶解其中的某些组分，然后通过减压，升温或吸附将其分离析出。u 超临界CO2萃取的特点：a、CO2超临界萃取具有广泛的适应性，特别对于天然物料 的萃取，其产品称得上是100%纯天然产品。b、可在较低温度下操作，特别适合于热敏性物质，完整保留生物活性，而且能把高沸点，低挥发度，易热解的物质分离出来。c、 溶剂没有污染，可以回收使用，简单方便，节省能源。d、须在高压下操作，设备与工艺要求高，一次性投资比 较大。6、 什么是超临界流体？它与一般流体相比具有什么特性？其形成的主要影响因素有哪些？ u 当一种流体处于其临界点的温度和压力之下，则称之为超临界流体。u 超临界流体（SCF）是指在临界温度和临界压力以上的流体，高于临界温度和临界压力而接近临界点状态，称为超临界状态。处于超临界状态时，气液两相性质非常接近，以至于无法分辨，故称为SCF。u 特点：密度接近液体萃取能力强 粘度接近气体传质性能好密度类似液体，因而溶剂化能力很强，压力和温度微小变化可导致其密度显著变化压力和温度的变化均可改变相变粘度, 扩散系数接近于气体,具有很强传递性能和运动速度SCF的介电常数，极化率和分子行为与气液两相均有着明显的差别7、 何谓双水相萃取?常见的双水相构成体系有哪些？u 双水相萃取是利用物质在不相溶的，两水相间分配系数的差异进行萃取的方法u 可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。u 双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，下相富含无机盐。8、 简述反胶团的构成与及反胶团萃取的基本原理。9、 反胶团形成需具备什么条件？其特性是什么？ 反胶团(reversed micelle)是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体 ，所以表面活性剂是反胶团溶液形成的关键。10、 影响反胶团萃取蛋白质的主要因素有哪些？u 水相pH值对萃取的影响u 离子强度对萃取率的影响离子强度对萃取率的影响主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用所决定的： a.离子强度增大后，反胶团内表面的双电层变薄，减弱了蛋白质与反胶团内表面之间的静电吸引，从而减少蛋白质的溶解度； b.反胶团内表面的双电层变薄后，也减弱了表面活性剂极性基团之间的斥力，使反胶团变小，从而使蛋白质不能进入其中； c.离子强度增加时，增大了离子向反胶团内“水池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向，使蛋白质从反胶团内被盐析出来；d.盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用，可以改变溶解性能，盐的浓度越高，其影响就越大。u 表面活性剂类型的影响u 表面活性剂浓度的影响u 离子种类对萃取的影响u 影响反胶团结构的其他因素：有机溶剂的影响、助表面活性剂的影响、温度的影响第四章 层析分离技术层析技术： (又称：色谱技术)是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），达到分离的目的。吸附层析：分配层析：离子交换层析：凝胶层析：又称凝胶过滤、分子排阻层析、分子筛层析亲和层析：亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的 。分配系数：可由Langmuir方程得出Kd-分配系数q、c-溶质在固相和液相中的浓度滞留时间：反应样品在柱子中的保留或阻滞的时间，是色谱过程的基本热力学参数之一1、 什么是层析分离技术？层析分离技术的分类有哪些？u 概念：层析技术(又称：色谱技术)是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），达到分离的目的。u 层析分离方法很多，种类有四、五十种。但常用于生物大分子分离的层析方法： 按机理分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析 按流动相分为：气相色谱、液相色谱（高压、中压、低压层析）2、 常用的层析分离技术可分为哪几种类型？其工作原理各是什么？吸附层析：样品组分对固定相表面吸附力不同进行组份分离分配层析：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数K不同而分离的方法离子交换层析：依据物質所帶阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交換剂有不同的亲和力，改变沖洗液的离子強度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出來凝胶层析：凝胶层析柱中装有多孔凝胶，混合各组分的溶液流经凝胶时又两种不同的运动：垂直向下的移动和布朗运动大分子物质分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布在凝胶颗粒的空隙中，以较快的速度流过凝胶柱小分子物质能进入凝胶内，不断地进出一个个颗粒的微孔内外，向下移动速度因而慢于大分子的速度各组分按照分子质量又大到小的顺序先后流出层析柱分子量不是唯一分离依据，分子形状、各物质与凝胶间的非特异性吸附作用也影响分离亲和层析：亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的 3、 什么是离子交换层析？其工作原理是什么？影响离子交换速度的因素有哪些？影响因素：颗粒大小：愈小越快交联度：交联度小，交换速度快温度：越高越快离子化合价：化合价与高，交换越快离子大小：越小越快搅拌速度：在一定程度上，越大越快溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时， 浓度越大，交换速度越快4、 什么是亲和层析？其工作原理是什么？5、 什么是凝胶层析？其工作原理是什么？6、 什么是吸附过程？影响吸附的主要因素有哪些？u 吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程。u 吸附过程通常包括：待分离料液与吸附剂混合、吸附质被吸附到吸附剂表面、料液流出、吸附质解吸回收等四个过程。u 影响因素：吸附剂的性质：比表面积、粒度大小、极性吸附质的性质：对表面张力的影响，溶解度，极性，相对分子量温度：吸附是放热过程，吸附质的稳定性溶液pH值：影响吸附质的解离盐浓度：影响复杂，要视具体情况而定7、 吸附的类型有哪些？它们是如何划分的？吸附类型：物理吸附： 吸附作用力为分子间引力、无选择性、无需高活化能、吸附层可以是单层，也可以是多层、吸附和解吸附速度通常较快。化学吸附：吸附作用力为化学键合力，需要高活化能、只能以单分子层吸附，选择性强、吸附和解吸附速度较慢。物理吸附化学吸附吸附作用力 分子间引力化学键合力选择性较差较高所需活化能低高吸附层单层或多层单层达到平衡所需时间快慢8、 什么是亲和吸附？亲和吸附的原理和特点是什么？u 亲和吸附分离是利用溶质和吸附剂之间特殊的化学作用，从而实现分离。u 吸附剂由载体（Carrier）和配位体(Ligand)组成u 特点：效率高：利用亲和吸附可以从粗提液中一次性分离得到高纯度的活性物质。分离精度高：可用于分离含量极低，结构相近的化合物通用性较差，洗脱条件苛刻9、 常用的离子交换树脂类型有哪些？n 强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）；n 弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH, -OCH2COOH, C6H5OH等弱酸性基团；n 强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基-羟基乙基胺基；n 弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱；10、 用于蛋白质提取分离的离子交换剂有哪些特殊要求，主要有哪几类？u 要求：良好的亲水性、具有较大的均匀网格结构、粒度越小分辨率越高u 种类：多糖类 离子交换纤维素 交联葡聚糖 交联琼脂糖 聚乙烯醇类 Mono系列 Amersham Pharmacia11、 简述高效反相液相色谱的工作原理？12、 试分析HPLC和HIC（疏水层析）技术的异同13、 离子交换的机理是什么？如何利用离子交换法分离蛋白质？平衡、上样吸附、洗脱、再生14、 什么是离子交换的选择性？其选择性受哪些因素影响？离子交换常数：交换势或交换系数R-A、R-B表示结合在树脂上的A离子和B离子浓度AS、BS表示溶液中A离子和B离子 越大B越易被交换影响因素：水合离子半径：半径越小，亲和力越大；n 离子化合价：高价离子易于被吸附；n 溶液pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，但不影响交换容量；n 离子强度：越低越好；n 有机溶剂：不利于吸附；n 交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少； n 树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力；15、 简述凝胶层析的分离原理及其分类交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺、聚丙乙烯凝胶16、 简述离子交换及疏水作用层析的基本原理17、 简述高效液相色谱的分离原理及应用18、 蛋白质分离的常用层析方法有哪些？蛋白质性质 层析技术净电荷 离子交换(IEX)大小 凝胶过滤(GF)疏水性 疏水层析(HIC), 反相层析(RPC)生物辩识 (配基特异性) 亲和层析(AC)配基特异性，净电荷, 疏水性 扩张柱床吸附技术 (EBA)有AC, IEX or HIC19、 层析分离技术共分几类？常用的蛋白质分离方法有哪些？并简述其原理。20、 何为理论塔板高度和理论塔板数？如何计算？色谱柱的理论塔板数N与高度H N-理论塔板数 tR-保留时间 W1/2-半峰宽理论塔板高度：L-柱长第五章 电泳分离技术电泳：是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电泳技术：指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。迁移率（泳动度）：/E 用U表示，称迁移率（mobility）。是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度。等电聚焦电泳：聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。电场强度：(E V/cm) 在给定长度毛细管的两端施加一个电场后所形成的电效应的强度；电渗现象：一个U形管的底部装上一块素烧瓷板（密封）管中装入液体，并在两端加入电极通电，就会看到负极的液面上升。因为瓷板带有负电荷，液体相对地带有正电荷，因而向负极移动。这种液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象毛细管电泳：(CE)又称高效毛细管电泳(HPCE),是指离子或带电粒子以毛细管为分离室,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的液相分离分析技术。由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大,易于散热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生,这是CE和传统电泳技术的根本区别。双向电泳：1、 何谓电泳？电泳的基本原理是什么？影响电泳速度的因素有哪些？u 原理：不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同。因此可使它们分离。u 颗粒在电场中的移动方向决定于颗粒所带电荷的种类。带正电荷的颗粒向电场的负极移动；带负电荷的颗粒向正极移动；净电荷为零的颗粒在电场中不移动。u 颗粒在电场中的移动速度主要决定于颗粒所带净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。u 影响电泳速度的因素：样品本身：带电量，分子大小，形状电场强度：电压缓冲液：成分， pH ，离子强度支持介质：电渗作用，吸附作用温度2、 电泳技术通常可分为哪几种类型？u 按分离原理分类： 移界电泳 （moving boundary EP）不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，如果用光密度计扫描可得出个个互相分离的峰 区带电泳 (zone EP)只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得出一个个台阶状的图形。 等速电泳 (isotachophoresis)在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按浓度对距离作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持 等电聚焦 (isoelectricfocusing)由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成pH梯度。被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率很高。u 根据操作方式分类：连续系统：缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。3、 常规聚丙稀酰胺凝胶电泳PAGE和SDS-PAGE电泳有何异同？ 介质 原理 特点PAGE法聚丙烯酰胺凝胶质荷比+分子筛凝胶不仅作为支持物，且以分子筛主动参与样品的分离。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶分子筛用于测定蛋白质亚基的分子量SDS-PAGE法：使复合物所带负电荷远超过天然蛋白本身电荷，消除了电荷效应，而分子量占主导。SDS（十二烷基磺酸钠）+蛋白 线性复合物SDS是一种阴离子去污剂，它在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在。这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合从而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。4、 何谓双相电泳？第一向根据蛋白质的等电点不同在PH梯度胶中等点聚焦（isoelectric focusing,IEF)第二向根据蛋白质的分子量大小不同在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)5、 电泳装置的基本组成6、 常用的凝胶电泳技术有哪些？聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE法）、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)、琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同，主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳，双向电泳等类型7、 SDS-PAGE电泳的基本原理及过程 SDS是一种阴离子去污剂，它在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在。这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合从而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子与SDS充分结合后，所带上的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而也就掩盖或消除了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异。 这样的蛋白质-SDS复合物在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率便不再受蛋白质原有电荷和形状等因素的影响，而主要取决于蛋白质分子量大小。8、 琼脂糖电泳的特点及其应用琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是由D半乳糖和3、6脱水L半乳糖结合的链状多糖 9、 等电聚焦电泳IEF-PAGE的基本原理是什么？u 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。u 电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。Pr进入时，不同的Pr移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的Pr得以分离。优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定Pr或多肽的等电点。缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的Pr。10、 简述双向电泳的概念及其特点。11、 毛细管电泳的基本工作原理是什么？与其他电泳相比它具有什么特点？U = Ue/Ueotm = Lt2/UV原理：毛细管的两端分别浸在含有电解质的储液槽中，管内也充满同样的电解质,其中一端与检测器相连.当样品被引入后,便开始施加电压，样品中各组分向检测器方向移动,溶质的迁移时间为:其中 Lt-有效长度；V-施加电压；U-溶质总流速；Ue-电泳速度；Ueo-电渗流速度可见，在毛细管长度一定，某时刻电压相同的条件下，迁移时间决定于电泳速度Ue和电渗流速度Ueo,而两者均随组分的不同荷质比而异;所以，基于荷质比的差异就可以实现组分的分离。第六章 离心分离技术差速离心：这是最普通的离心法。即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。密度梯度离心：用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。等密度梯度离心：当欲分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，在离心力作用下，不同浮力的物质颗粒或向下沉降,或向上漂浮，一直移动到与它们各自浮力密度恰好相等的位置(等密度点) ，形成区带。这种方法称为等密度梯度离心，或称为平衡密度离心。沉降系数S：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。1、 何谓沉降？2、 沉降与离心的异同？3、 离心设备可分为哪几大类？各有什么特点？常见的有管式和碟片式（喷嘴型）两大类离心机可分为工业用离心机和实验用离心机。实验用离心机又分为制备性离心机和分析性离心机。u 制备性离心机主要用于分离各种生物材料，每次分离的样品容量比较大，分析性离心机一般都带有光学系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在离心场中的行为（用离心机中的光学系统连续监测），能推断物质的纯度、形状和相对分子质量等。u 分析性离心机都是超速离心机。制备性离心机可分为三类:l 低速离心机:最大转速8000 rpm左右，最大相对离心力约为10000g，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离。可用水平转头，角度转头 ，其转速不能严格控制。通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。这种离心机多用交流整流子电动机驱动，电机的碳刷易磨损，转速是用电压调压器调节，起动电流大，速度升降不均匀，一般转头是置于一个硬质钢轴上，因此精确地平衡离心管及内容物就极为重要，否则会损坏离心机。l 高速离心机：最大转速为10000-25000rpm（r/min），最大相对离心力为100000g，分离形式也是固液沉降分离，通常配有各种角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头。一般都有制冷系统，以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量，离心室的温度可以调节和维持在0-40oC，转速、温度和时间都可以严格准确地控制，并有指针或数字显示。通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、蛋白质的硫酸铵沉淀物和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。l 超速离心机：大于2.510104 r/min，最大离心力106g，有驱动和速度控制系统，温度控制系统，真空系统（减少摩擦）。新式的有微处理机（按编定程序运转，自动计算速度和时间）。有40多种不同容量和性能的转头给用户选择。离心容量由几十毫升至2升，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡允许的误差要小于0.1克。超速离心机的出现，使生物科学的研究领域有了新的扩展，它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。4、 常用的离心沉降设备有哪些？5、 什么是密度梯度离心和等密度梯度离心？它们在操作原理上有什么异同之处？第七章 化学检测技术免疫扩散：利用蛋白质在半固体基质上的扩散作用，使抗原和抗体在浓度比例适当的部位产生沉淀带或沉淀环，从而检测蛋白。免疫电泳：火箭电泳：火箭电泳也称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特点是需时较短，故可用于快速沉淀标本中抗原的含量。酶联免疫检测ELISA：是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除。免疫标记技术：用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。1、 在生化研究领域中，化学检测技术主要包含有哪些内容？化学检测是根据物质的化学性质而对物质进行定性、定量测定的方法，主要包括： 1.糖类化学检测 2.蛋白质化学定量检测 3.蛋白质氨基酸序列检测 4.蛋白质免疫化学检测 5.核酸化学检测2、 对糖类物质的检测技术有哪些？在化学法中常用的方法又有哪些？（1） 物理法、化学法、色谱法、酶法、发酵法、重量法（2） 物理法包括相对密度法、折光法、旋光法化学法包括还原糖法（直接滴定法、改良的兰-爱农法、高锰酸钾法、萨氏法）、碘量法、比色法（3，5-二硝基水杨酸、酚-硫酸法、蒽酮法、半胱氨酸-咔唑法）n 主要的糖类化学检测技术： 1. 兰爱农法 2. 斐林试剂快速法 3. 次碘酸钠法 4. 铜试剂法 5. 苯酚硫酸法 6. 蒽酮硫酸法 7. 3，5二硝基水杨酸法（DNS法）3、 在糖的化学检测中，兰爱农（Lane-Eynon）法和碘量法的工作原理分别是什么？u 兰-爱农法：此法以次甲基蓝为指示剂，直接用糖液滴定到斐林试剂中进行测定； 或者将糖液加到斐林试剂中，再用标准葡萄糖液反滴定。又称置换法，直接滴定法或者次甲基蓝法。 原理：糖液滴到斐林试剂中时，还原糖中的游离羰基与酒石酸钾钠铜反应，使二价铜离子还原生成一价的氧化亚铜沉淀。 由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，当二价铜离子全部被还原后，过量一滴还原糖立即使次甲基蓝还原，溶液的蓝色消失，从而显示反应终点。u 碘量法：此法是利用碘与氢氧化钠反应生成次碘酸钠，氧化还原糖的自由醛基，过量的碘再用硫代硫酸钠滴定，从而测定糖的含量。 次碘酸钠氧化能力比较弱，所以只适用于醛糖的滴定，与酮糖不起反应。4、 在蛋白质的化学检测中，福林-酚试剂法的工作原理是什么？福林-酚试剂由两种试剂组成，其中的碱性铜试剂能与蛋白质中的肽键发生双缩脲反应生成蛋白质-铜复合物。另一种稀释的苯酚试剂则与酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸残基反应，呈现蓝色。两种显色反应可以叠加，所以此法具有很高的敏感性。5、 在核酸的化学检测中，常用的方法有哪些？试分别说明其工作原理。根据核酸中所含的磷及戊糖的化学性质测定核酸的含量，主要方法有定磷法、二苯胺法和地衣酚法。n 定磷法：核酸中含的磷，用强酸消化，变成无机磷。无机磷在酸性条件下与钼酸铵反应生成磷钼酸。在还原剂作用下，磷钼酸生成蓝色的化合物钼蓝。钼蓝在650-660nm波长处有最大吸收峰，通过测定OD650，测定磷的含量，进一步可算出核酸含量。n 二苯胺法：DNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应。在595nm处有最大吸收峰。在40400ug范围内，OD与DNA浓度成正比。少量的乙醛可提高反应灵敏度，在使用前加入到配制好的二苯胺试剂中。n 地衣酚法测RNA含量：核糖核酸在浓盐酸和三氯化铁存在下，与3,5二羟甲苯反应生成绿色物质，该绿色物质在670nm处有光吸收高峰，在一定浓度范围内，吸光度和RNA浓度成正比。6、 抗原-抗体反应通常包含有哪几种形式？可分为几种阶段？u 抗原-抗体反应包括沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体结合反应和中和反应等。 u 抗原抗体反应可分为两个阶段 特异性结合阶段（分子表面的非 共价键结合） 可见的反应阶段7、 什么是免疫标记技术？通常包含有哪几种类型？n 用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。n 免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术第八章 光学检测技术 光学检测技术：利用物质所具有的各种光学性质，对物质进行定性、定量及结构分析的技术。 光谱分析法：基于物质与辐射能作用时，分子发生能级跃迁而产生的发射、吸收或散射的波长或强度进行分析的方法； 非光谱分析法：不涉及能级跃迁，物质与辐射作用时，仅改变传播方向等物理性质； Lambert-Beer定律：A=lg(I0/It)=kbc 意义：当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比. 旋光检测技术：利用旋光计测量出旋光物质（光学活性物质）对偏振光旋转角度的方向（左旋或右旋）和大小，从而进行定性与定量分析的技术，称为旋光检测技术。 旋光度：当偏振光通过光学活性物质溶液时，偏振面旋转的角度 叫作该物质的旋光度。 比旋光度：在一定温度和一定光源情况下，当溶液浓度为 1 g/ml ，液层厚度为 1分米 时偏振光所旋转的角度。 变旋光作用：具有光学活性的还原糖类(如葡萄糖，果糖，乳糖，麦芽糖等)，在溶解之后，其旋光度起初迅速变化，然后惭渐变得较缓慢，最后达到恒定值，这种现象称为变旋光作用。1、 光学检测技术的内容主要有哪些？在生化领域中常用的方法是什么？试分别解释其原理。 包括：旋光检测、折光检测、荧光检测、分光光度检测、散射光谱检测等。 生化领域常用：分光光度检测、旋光检测、荧光检测2、 简单介绍光分析法的定义及其分类？光分析法：基于电磁辐射能量与待测物质相互作用后所产生的辐射信号与物质组成及结构关系所建立起来的分析方法；光谱法（原子光谱、分子光谱）、非光谱法3、 非光谱分析法包含有哪些方面内容？ 偏振法、干涉法、旋光法等4、 光谱分析法包含有哪些方面内容？原子光谱（线性光谱）：常见的有下面四种:n 基于原子外层电子跃迁的：原子吸收光谱（AAS）、原子发射光谱（AES）、原子荧光光谱（AFS） n 基于原子内层电子跃迁的： X射线荧光光谱（XFS）分子光谱（带状光谱）：基于分子中电子能级、振-转能级跃迁： 紫外光谱法（UV）； 红外光谱法（IR）； 分子荧光光谱法（MFS）； 分子磷光光谱法（MPS）； 核磁共振与顺磁共振波谱（N）；A=lg(I0/It)=kbc5、 什么是光吸收的基本定律？其内容是什么？光吸收基本定律：朗伯-比尔定律意义：当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比.6、 应用光学分析法对物质进行定性、定量测定的原理分别是什么？7、 什么是旋光检测技术？其对物质进行定性、定量检测的依据是什么？利用旋光计测量出旋光物质（光学活性物质）对偏振光旋转角度的方向（左旋或右旋）和大小，从而进行定性与定量分析的技术，称为旋光检测技术。8、 什么是变旋光作用？在实际检测中如何操作可减轻其影响？u 具有光学活性的还原糖类(如葡萄糖，果糖，乳糖，麦芽糖等)，在溶解之后，其旋光度起初迅速变化，然后惭渐变得