TUNEL联合免疫组化方法.doc

TUNEL联合免疫组化的实验步骤一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光)1、常规程序制备石蜡组织块和5 wm厚石蜡组织切片。2、然后按照TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒的标准步骤进行TUNEL染色。对于石蜡切片：a.二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。b.滴加20g/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。c.用PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。d.在用PBS配制的3%过氧化氢溶液(3%H2O2inPBS)中室温孵育10分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。随后用PBS或HBSS洗涤3次。注：请勿在用PBS配制的3%过氧化氢溶液中孵育过长时间，否则会出现过氧化氢导致的DNA断裂，从而产生假阳性。e. 配制生物素标记液：参考下表配制适量的生物素标记液，需充分混匀。注意：配制好的生物素标记液必须一次使用完毕，不宜冻存。f.样品的生物素标记：1.在样品上加50l生物素标记液，37孵育60分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少生物素标记液的蒸发。2.用PBS或HBSS洗涤1次，滴加0.1-0.3ml标记反应终止液，室温孵育10分钟。3.用PBS或HBSS洗涤3次。g.Streptavidin-HRP工作液和DAB显色液的配制：a.Streptavidin-HRP工作液的配制：参考下表配制适量的Streptavidin-HRP工作液，需充分混匀。注意：配制好的Streptavidin-HRP工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。h. DAB显色液的配制：按照每个样品使用0.2-0.5ml显色液的比例配制适量DAB显色液。等体积混合适量DAB显色液A和DAB显色液B，充分混匀后即为DAB显色液。注意：配制好的DAB显色液必须一次使用完毕，不宜冻存。i. 样品的DAB显色：(1)在样品上加50lStreptavidin-HRP工作液，室温孵育30分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少Streptavidin-HRP工作液的蒸发。(2)用PBS或HBSS洗涤3次。(3)滴加0.2-0.5mlDAB显色液，室温孵育5-30分钟或根据显色情况孵育适当时间。注：如果显色很强可以短于5分钟即停止显色，如果显色很弱，可以适当延长显色时间，甚至显色过夜。(4)用PBS或HBSS洗涤3次。(5) 选做(本步骤可不做)：用苏木素染色液(C0107)或甲基绿染色液(C0115)进行细胞核染色。随后用PBS或HBSS洗涤3次。(6)直接进行观察，或用95%乙醇脱水5分钟，再用100%乙醇脱水2次，每次约3分钟，再用甲苯透明2次，每次5分钟，随后封片观察。染色结果可参考下图：3、 TUN EL显色完毕后，切片人o. O5%Tween-20的PBS缓冲液中，置千加温摇床上洗3遍，浸泡于PBS中10 min,然后进行免疫组织化学染色。4、 510正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37孵育12小时或4过夜。5、 PBS冲洗，5分钟3次。6、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37孵育1030分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37或室温孵育1030分钟。7、 PBS冲洗，5分钟3次。8、 显色剂显色（DAB或AEC）。荧光TUNEL联合免疫荧光的实验步骤TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)1、常规程序制备石蜡组织块和5 wm厚石蜡组织切片。2、然后按照TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒的标准步骤进行TUNEL染色。对于石蜡切片：a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。b. 滴加20mg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。c. PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。3、 配制TUNEL检测液：参考下表配制适当量的TUNEL检测液，需充分混匀。注意：配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕，不能冻存。a. 用PBS或HBSS洗涤2次。b. 在样品上加50l TUNEL检测液，37避光孵育60分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少TUNEL检测液的蒸发。c. PBS或HBSS洗涤3次。d. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。Cy3的激发波长为550nm，发射波长为570nm (红色荧光)。4、PBS（0.01M）浸洗3次，每次3min。5、0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）； 6、PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温（6%山羊血清，PBS配置）封闭30min。 7、 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗，并放入湿盒，4孵育过夜； 8、37度复温45min，加荧光二抗（PBS配置）。 PBS浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37孵育1h，PBS浸洗切片3次，每次3min； 注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。 二抗一定要用蓝色荧光的，因为TUNEL为红色荧光，慢病毒G