多糖提取纯化以及结构解析.ppt

2012 10 31 多糖提取 纯化及结构分析文献总结 汇报人 周函钰 2012 10 31 糖类介绍 多糖提取 多糖纯化 多糖结构分析 2012 10 31 2012 10 31 糖类 Carbohydrates 物质是含多羟醛或多羟酮类化合物 主要由C H O组成 其分子式常用Cn H2O n来表示 定义 2012 10 31 Content welcometousethesePowerPointtemplates NewContentdesign 10yearsexperience 糖类广泛分布于生物体中 可以分为单糖 低聚糖和多糖 目前已发现不少糖类及其衍生物具有药用价值 尤其在抗凝 降血脂 提高机体免疫和抗肿瘤 抗辐射方面都具有很广泛的应用 糖类分布 2012 10 31 糖的分类 2012 10 31 2012 10 31 单糖 低聚糖常用水或醇提取 然后用不同的有机溶剂萃取得到不同极性的化合物 多糖常用热水 稀碱或稀酸溶液进行提取 植物体内苷常与水解酶共存 所以要杀酶或抑制酶的活性 脱脂 去杂 浓缩 再次去杂 脱色 浓缩 冷却 结晶 进一步纯化 2012 10 31 2012 10 31 2012 10 31 2012 10 31 2012 10 31 2012 10 31 2012 10 31 利用不同多糖与金属离子成盐后在水溶液中的特异性沉淀作用 用硫酸铵 乙酸钾 氯化钾等盐析剂 将不同的多糖逐步析出 盐析法原理原理 金属配合物法原理 利用不同多糖能与金属离子形成配合物而沉淀下来 使用多种配位剂沉淀多糖 2012 10 31 长链季铵盐是碱性表面活性剂 酸性多糖在溶液中以聚阴离子形式存在 它就与季铵盐或其碱形成不溶性配合物沉淀 又由于多糖分子酸性越强 相对分子质量越大越易沉淀出来 这样控制季铵盐浓度即可以分理出不同的酸性多糖 季铵盐沉淀原理 2012 10 31 2012 10 31 2012 10 31 分子筛原理 按照分子量的大小不同进行分离 常用葡聚糖凝胶 sephadexG 凝胶柱色谱原理 除此之外 还有膜分离技术 超滤膜术等也应用于多糖的分离纯化 2012 10 31 常用的脱色方法 对于植物来源的多糖 可能含有酚型化合物而颜色较深 对其进行脱色可使其应用范围更加广泛 常用的脱色方法有 离子交换法 氧化法 金属络合物法 吸附法 纤维素 硅藻土 活性炭等 Addyourtitle 一般情况下 尽量避免用活性炭处理 因活性炭会吸附多糖 造成多糖损失 2012 10 31 黏多糖 又叫酸性黏多糖 是一类广泛存在于动物体内的含糖醛酸和氨基糖残基的复合多糖 这是一类较有发展潜力的新型生化药物或生物制品 提取 黏多糖大多与蛋白质共价结合 首先常用酶降解部分蛋白或用碱使多糖 蛋白质间的键断裂 促进提取时的溶解 然后用普通蛋白沉淀法沉淀蛋白 2 分离 有机溶剂分离法利用不同浓度的乙醇依次沉淀不同的黏多糖 季铵化合物沉淀法其含有酸性基团 与表面活性剂形成季铵配合物 然后用不同盐离子浓度解离 离子交换层析法用阴离子交换剂交换吸附 再用NaCl溶液进行梯度洗脱 2012 10 31 2012 10 31 多糖是由多个单糖基以糖苷键相连而形成的高聚物多糖的结构包括单糖的组成 糖苷键的类型 单糖的排列顺序3个基本结构因素 多糖的生物大分子结构比蛋白质更为复杂 这不仅因为组成多糖的单糖品种繁多 目前已知的单糖有200多种 而且即使只有一种单糖组成的多糖其连接方式的不同以及可能有的支链 蛋白质支链较少 造成多糖的结构测定非常困难 2012 10 31 概念 多糖由多个单糖以糖苷键相连而成的高分子聚合物 方向 左 非还原端 右 还原端 多糖的性质 胶体溶液 无甜味 无还原性 有旋光性 但无变旋现象 2012 10 31 多糖的结构 一级结构 单糖的组成 糖苷键的类型 单糖的排列顺序 二级结构 取决于一级结构 指其分子骨架 2012 10 31 多糖的种类 1 均一多糖 同多糖 由一种单糖缩合而成 2012 10 31 不均一多糖 杂多糖 由不同类型单糖缩合而成 2012 10 31 一 分子量及分子式的确定质谱分析测定分子量和分子式 苷类化合物一般极性较大 无挥发性 遇热气化时易于分解 采用电子轰击质谱 EI MS 常常不能获得分子离子峰 现多采用化学电离质谱 CI MS 场解吸质谱 FD MS 快原子轰击质谱 FAB MS 和电喷雾质谱 ESI MS 等方法来获得分子离子蜂 尤其是ESI MS及FAB MS两种质谱法更是目前测定苷类分子量常用的方法 2012 10 31 组成苷的苷元和单糖的鉴定一般是将苷键全水解 用PC检出单糖的种类 糖类的PC常用的展开剂大多为含水的溶剂系统 如正丁醇 醋酸 水 4 1 5 EtOAc 吡啶 水 2 1 2 等 经显色后用薄层扫描法求得各种糖的分子比 用GC或HPLC对单糖定性定量 GC常以甘露醇或肌醇为内标 用已知单糖作为对照品 NMR谱 也可以有效地鉴定苷分子中糖的种类 苷分子量 苷元分子量 求出糖的数目 氢谱中端基质子信号数 5ppm左右 碳谱中端基碳信号的数目 90 112ppm 2012 10 31 苷元和糖之间连接位置的确定13C NMR 苷化位移规律 将苷和苷元的碳谱相比较 成苷后 C约 8ppm C约 4ppm二维核磁共振谱 如HMQCCOSY及HMBC谱 等技术广泛用于确定连糖位置 2012 10 31 糖与糖的连接位置的确定全甲基化物进行甲醇解 分析其甲醇解产物 甲基化法虽然不能解决多糖中单糖的连接顺序 但它对于阐明单糖的连接方式 键构型 重复结构中某种单糖的数目 末端糖的性质以及分支点的位置等非常有用 2012 10 31 采用的方法通常是将这些甲基化的单糖进行了TLC鉴定 并与标准品对照 近来亦有用GC MS联用仪对其进行鉴定的报道 全甲基化甲醇解 2012 10 31 苷键构型的确定酶水解转化糖酶 水解 果糖苷键麦芽糖酶 水解 葡萄糖苷键杏仁苷酶 水解 葡萄糖苷键 专属性较低纤维素酶 水解 葡萄糖苷键NMR谱法测定利用端基质子的偶合常数利用 苷键和 苷键的端基碳的化学位移差别利用2D NMR谱 201