酶工程学-第七-十周酶改性理论.ppt

绪论 第一章 酶的生产 酶的改性 酶的应用 酶生物合成的基本理论 第二章 酶的生物合成法 第三章 酶的提取与分离纯化 第四章 酶改性的基本理论 第五章 酶分子修饰 第六章 酶固定化 第七章 酶的非水相催化 第八章 酶应用的基本理论 第九章 酶反应器的应用 第十章 酶的应用领域 第十一章 酶的改性 通过各种方法使酶的催化性质得以改进的技术 第五章酶改性的基本理论 第一节酶的结构和组成 一 酶的结构和组成 分子组成 单体酶 一条多肽链 一个活性中心寡聚酶 多个亚基 多为偶数多功能酶 2个或更多催化 结合功能 单纯酶结合酶 含辅酶 辅因子 分子特点 化学组成 乙酰CoA 7丙二酸CoA 14NADPH 14H 棕榈酸 7CO2 8CoA 14NADP 6H2O 脂肪酸合成酶 缩合 还原 脱水 还原 全酶 holoenzyme 脱辅酶 apoenzyme 辅助因子 cofactor 一 酶的基本成分 辅基 prostheticgroup 辅酶 co enzyme 金属离子 也可归入辅基 结合力强 二 辅酶 辅基 辅酶在参与反应过程中 直接参加了反应 每一种辅酶都具有特殊的功能 可以特定地催化某一特定类型的反应 在反应中起运载体的作用 传递电子 质子或其他基团 同一种辅酶可以和多种不同的酶蛋白结合形成不同的全酶 一般来说 全酶中的辅酶决定了酶所催化的类型 反应专一性 而酶蛋白则决定了催化的底物类型 底物专一性 辅酶 辅基的作用特点 举例 1 焦磷酸硫胺素 TPP 脱羧酶的辅酶 催化丙酮酸或 酮戊二酸的氧化脱羧反应 所以又称为羧化辅酶 丙酮酸脱羧酶系 E1 丙酮酸脱羧酶E2 硫辛酸乙酰转移酶E3 二氢硫辛酸脱氢酶 TPP 辅酶 辅基的作用特点 举例 2 FDA FMN在脱氢酶催化的氧化还原反应中起电子和质子传递体的作用 辅酶 辅基的作用特点 举例 3 CoA是生物体内代谢反应中乙酰化酶的辅酶 作用是传递乙酰基 是形成代谢中间产物的重要辅酶 辅酶A CoenzymeA CoA CoASH或HSCoA 主要参与脂肪酸以及丙酮酸的代谢 三 酶分子中的金属离子 根据金属离子与酶结合的程度 可分为两类 金属酶和金属激活酶 金属酶 酶蛋白与金属离子紧密结合 如Fe2 Fe3 Cu Cu2 Zn2 Mn2 Co2 等 金属激活酶 金属离子为酶的活性所必需 但是与酶结合不牢 金属离子的作用 稳定酶的构象 参与催化反应 传递电子 在酶与底物间起桥梁作用 中和阴离子 降低反应中的静电斥力 四 酶的活性中心 活性中心 必需基团 活性中心 底物结合部位 催化部位 活性中心的必需基团活性中心以外的必需基团 1 酶分子结合部位 酶分子中与底物结合的部位或区域 2 催化部位 酶分子中促使底物发生化学变化的部位 通常将酶的结合部位和催化部位总称活性部位或活性中心结合部位决定酶的专一性 催化部位决定酶所催化反应的性质 胰凝乳蛋白酶 胰弹性蛋白酶 N Lys C Arg 63 3 调控部位 酶分子中存在一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位 从而引起酶分子空间构象的变化对酶起激活或抑制作用 4 必需基团 5 活性中心的特点 1 酶的活性部位是由处于多肽链上不同部位的氨基酸残基组成 2 活性部位由酶蛋白上少数氨基酸残基组成 3 活性部位处于酶蛋白上的裂缝处 6 酶的一般特征 第二节酶的高效催化作用机制 一 化学反应速率依赖的因素 二 几个重要的概念 三 酶的高催化效率 四 酶的高效催化作用机制 中间产物学说 一 中间产物学说Brown 1902 Henri 1903 1 酶 底物复合物存在的证据 1 酶促反应过程中最大速度的存在预示着ES的存在 2 X ray晶体衍射分析表明ES复合体的存在 X Ray 0 1 100 电磁波 1895年 伦琴 3 光谱学分析结果表明存在ES Ser 吲哚Trp 色氨酸酶 2 酶与底物的结合方式 1958年 Koshland 3 底物的过渡状态 张力效应 1885年 vonBaeyer 张力学说 阿道夫 冯 拜尔于1885年用以解释不同环烷烃的稳定性而提出的一个理论 这个学说认为 所有环状化合物都具有环平面结构 由于键角 即多边形内角 与sp3杂化轨道正常键角 109 28 有差别 因此所有环系都存在角张力 这个偏转角可以用 sp3杂化轨道正常键角 多边形内角 2来计算 化合物的键角离理想的四面体排列越远化合物越不稳定 约翰 弗雷德里克 威廉 阿道夫 冯 拜尔 JohannFriedrichWilhelmAdolfvonBaeyer 1835年10月31日 1917年8月20日 德国化学家 因成功分析出吲哚的结构而获得1905年诺贝尔化学奖 1885年 vonBaeyer 4 敏感键变形 降低活化能 二 邻近效应和定向效应 正确取位在游离的反应物体系中很难解决 邻近效应 举例 定向效应 三 多元催化作用 乳酸 一个底物或底物的一部分与催化剂形成共价键 然后被转移给第二个底物 四 表面效应 第三节酶促反应的高度特异性 一 酶促反应具有高度特异性 琥珀酸脱氢酶 二 酶促反应特异性机制 1894年 Fisher 1958年 Koshland 第四节酶促反应动力学及米氏方程 是研究酶催化反应速度及其影响因素的学科 酶的作用机制酶在细胞内条件下的作用控制酶的活性 O2 H2 H2O DG 237 35KJ NO2 N2O4 DG 5 40KJ 化学反应两个基本问题 热力学问题 反应进行的方向 可能性 限度动力学问题 速率 反应机制 一 各种因素对酶反应速度的影响 底物浓度的影响酶浓度的影响温度 pH的影响抑制剂 激活剂的影响 一 酶反应的初速度与底物浓度之间的关系 实验上只有初速度的测定才有意义 一级反应 混合级反应 零级反应 二 酶催化的反应中各成份的变化 S EESE P S substanceP productE enzyme 发生在很短的时间内 三 酶浓度对反应速度的影响 S EESE P k3 E ES 四 温度的影响 五 pH的影响 二 Michaelis Menten方程 1913年 根据实验数据推导 M M思路 M M思路 反应中只有一个中间复合体 反应的第一步是可逆反应 并保持始终 反应的第二步是限速步骤 ES分解生成P的速率不足以破坏E和ES之间的快速平衡 k2 k3 S S 0 酶在反应中不被消耗 酶守恒公式 E t E ES P 接近于零 因此米 曼氏方程只适用于反应的初速率 存在的问题 1925年Briggs和Haldan按照 稳态理论 重新推导 酶反应分两步 1925年Briggs和Haldan按照 稳态理论 重新推导 Michaelis和Menten快速平衡法 Briggs和Haldan稳态理论 米氏方程 k4 A B C D k3 k3 y kx b S V S Vmax Km Vmax V Vmax KmV S 两种不同模式的双底物反应 顺次式 sequential 乒乓式 ping pong 双底物反应的米氏方程 当P1 P2 0时 太复杂了 忘了我吧 1 焦磷酸酶在细菌的DNA合成过程中发挥重要作用 已知焦磷酸酶的分子量为120Kd 该酶有6个同样的亚基组成 该酶的一个活力单位定义为在37 时 15分钟内水解10 M焦磷酸所需要的酶量 该酶的Vmax为2800U mg 1 当体系中焦磷酸的浓度远远大于时Km 每秒钟内每毫克酶能够水解多少摩尔焦磷酸 2 假定该酶的每个亚基只含有一个活性部位 1mg酶含有多少摩尔活性部位 3 该酶的转换数是多少 思考题 2 青霉素能够被青霉素酶 也叫内酰胺酶 水解而失活 一些细菌中含有青霉素酶因而对青霉素具有抗性 青霉素酶的分子量为29 6Kd 在一个10ml的反应体系中含有10 9g纯青霉素酶 测定在一分钟内该反应体系中青霉素被催化的速度 结果如下表所示 假定青霉素的浓度在测定过程中不发生变化 a 分别以V0对 S 和1 V0对1 S 作图 在上述反应中青霉素酶遵循Michaelis Menten动力学吗 b 上述反应的KM和Vmax分别是多少 c 在上述反应中青霉素酶的转换数是多少 每一个青霉素酶分子只含有一个活性中心 3 判断抑制剂的类型 分别在含有2mM抑制剂及不含有抑制剂的情况下测得的酶催化反应的结果如下表所示 1 在两种情况下酶促反应的Km和Vmax分别是多少 2 上述反应属于那种抑制类型 3 计算抑制常数 4 如果底物的浓度为10mM 抑制剂的浓度为2mM 计算与底物结合的酶占全部酶量的分数 5 如果底物的浓度为30mM 计算当体系中含有2mM抑制剂及不含抑制剂的情况下与底物结合的酶占全部酶量的分数 4 假定酶A遵循简单的米氏动力学 计算当底物的浓度为1 10Km 酶催化反应的初始速度为1mmol min时 酶催化反应的最大速度 5 对于单底物酶催化的反应 测定三种酶浓度条件下的酶的反应速度与底物浓度之间的关系 利用双对数法绘制的底物浓度与最大反应速度之间的关系曲线 下列那组曲线是正确的 第五节多种因素对酶促反应速度的影响 一 抑制剂的影响 抑制剂的种类 竞争性抑制剂非竞争性抑制剂反竞争性抑制剂 不可逆抑制剂可逆抑制剂 氯乙烯氯砷 叶酸 VB9 四氢叶酸的作用 磺胺类药物的抗菌机理 一碳单位转移酶的辅酶 参与核酸前体物 嘌呤 嘧啶 的合成 体内四氢叶酸的合成 氨甲喋呤的抗癌机理 氨甲喋呤 I 竞争性抑制 反竞争性抑制 非竞争性抑制 无抑制剂 竞争性抑制剂 非竞争性抑制剂 反竞争性抑制剂 Km S Km S 判断抑制剂的类型 分别在含有2mM抑制剂及不含有抑制剂的情况下测得的酶催化反应的结果如下表所示 1 在两种情况下酶促反应的Km和Vmax分别是多少 2 上述反应属于那种抑制类型 3 计算抑制常数 4 如果底物的浓度为10uM 抑制剂的浓度为2mM 计算与底物结合的酶占全部酶量的分数 5 如果底物的浓度为30uM 计算当体系中含有2mM抑制剂及不含抑制剂的情况下与底物结合的酶占全部酶量的分数 二 激活剂的影响 激活剂 凡能使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质 金属离子 Mg2 Mn2 K 阴离子 Cl 有机酸