醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用.pdf

开发应用2009 Vol 26 No 11化学与生物工程 Chemistry 2 西部矿业股份有限公司国家级企业技术中心 青海 西宁810001 摘 要 醛酮还原酶是氧化还原酶家族成员之一 能对很多羰基底物进行氧化还原 综述了醛酮还原酶家族的命 名 结构 保守氨基酸序列 催化机制 结合辅酶方式和结合底物的特异性 阐述了醛酮还原酶生理作用的研究方法 介绍 了醛酮还原酶在手性醇合成方面的应用 关键词 醛酮还原酶家族 辅酶 底物特异性 手性醇 不对称合成 中图分类号 Q 554 12 文献标识码 A 文章编号 1672 5425 2009 11 0062 06 醛酮还原酶 A KR 是氧化还原酶超家族成员之 一 在生物界中广泛存在 能对很多羧基底物进行氧化 还原 特别是对生物体而言是很强突变剂的醛或酮中 间产物 1 醛酮还原酶通常都是单体 约含320个氨 基酸残基 大小约为35 kDa 其底物谱很广 包括脂肪 族和芳香族的醛基 酮基 单糖 类固醇 前列腺素等 目前有三种已知的酶显示出了典型的醛酮还原酶 家族特性 第一种是醛还原酶 Aldehyde reductase EC1111112 能催化各种醛基的还原 如糖醛酸 第二 种是醛糖还原酶 Aldose reductase EC11111121 能 催化乙醇醛和多羟基醛等的还原 但对糖醛酸中醛基 的还原活性较弱 第三种是羰基还原酶 Carbonyl re2 ductase EC111111184 能催化醌 酮基及醛基还原成 相应的醇 1 醛酮还原酶的命名 醛酮还原酶的命名方式为 词头 A KR 代表醛酮 还原酶 其后的阿拉伯数字代表其所属的家族 接着的 字母代表亚家族 最后的阿拉伯数字代表其独特的蛋 白质序列 2 例如 蛋白质A KR7A1是指醛酮还原酶 第七个家族的亚家族A 其编码基因为A KR7A1 对 于多聚体的醛酮还原酶 则根据其组成成分的比例来 命名 如 A KR7A12A KR7A4 1 3 指的是一个四聚 体 其 组 成 为1分 子 的A KR7A1和3分 子 的 A KR7A4 2 醛酮还原酶的家族成员 A KR超家族目前已经分成了15个家族 A KR1 A KR15 约有150个家族成员 还有约130个未列 入家族中的还未确定功能的蛋白质 它们也很有可能 具有醛酮还原酶活性 这种最初由Jez提出的分类方 式是根据蛋白质序列分类的 3 A KR家族成员间的氨基酸相似度低于40 而 每个家族内部成员间的相似度却远远大于60 当 蛋白质具有大于97 的氨基酸一致性时 被认为是一 类 除非它们具有不同的酶活性或不同的3 非翻译区 U TR 或者具有不同的基因结构和 或染色体定 位 2 在15个家族中 最大的家族是A KR1 其家族 成员有醛糖还原酶 醛还原酶 羟基类固醇脱氢酶等 3 醛酮还原酶的结构 A KR家族成员的催化中心为D2Y2K2H 且以 2 折叠的羧基端与辅酶结合 这与短链脱氢酶不同 后者 是通过Rossmann折叠区域和NAD P H 结合 4 A KR家族成员都具有相同的三维结构 8桶 状折叠 以大麦醛糖还原酶即A KR4C1的结构为例 见图1a 结构中具有8个平行的 2折叠 每个 2折叠 都和一个 2螺旋交替 2螺旋和 2折叠呈反向平行 且 2折叠的羧基端是通过一些可变长度的环与 2螺旋的 氨基端结合 这些环形成了活性中心 实际上 参与底 李凌凌等 醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用 2009年第11期 63 物结合和催化作用的残基主要在三个环 A2 B2和 C2环上 图 1b 并根据它们在一级结构上的位置命名 A2环位于残基124 142 B2环位于残基219 225 C2 环位于残基292 320 均在桶状结构的羧基端 非常 柔软 从而使得酶能适应不同大小形状的底物 并控制 催化等分子事件 5 A KR家族成员中这三个环的长 度和氨基酸序列均不同 此外 A KR结构中的发夹结 构 B1 B2 封锁了桶状结构的一端 而NAD P H的 结合位点位于另一端 6 该结构具有高度保守的辅酶 结合 口袋 并有两个辅助的 2螺旋H1和H2 其中 2螺旋H1定在辅酶结合环的一端 负责连接第 7个 2 折叠和第7个 2螺旋 而 2螺旋H2则锚定在羧基端 环的第8个 2螺旋之后 图1 AKR 大麦醛糖还原酶 的三维结构 6 Fig 1 A common three2dimensional structure of AKR Hordeum vulgarealdose reductase 311 AKR家族成员中的保守氨基酸 醛酮还原酶家族的序列比对结果显示含有三个保 守序列 N端为LxxxGxxxPxxGxG x代表可变氨基 酸 活性中心为GxxxDxAxxY 其中含有保守的Asp 和Tyr 还有一个保守区域为LxxxxxxxxxDxxxxH 含有保守的 His 所有A KR家族成员的一级结构中 有11个位点 的氨基酸是严格的保守 7 Gly22 Gly45 Asp50 Lys84 Asp112 Pro119 Gly164 Asn167 Pro186 Gln190和Ser271 这里的数字根据3 2羟基类固醇脱 氢酶即A KR1C9的蛋白质残基顺序编号 另外 有 41个家族成员在额外的8个位点的氨基酸是保守的 Gly20 Tyr55 Gly62 Leu113 Trp148 Gly158 Glu192 Arg276 其 中Asp50 Asn167 Gln190 Ser271和Arg276是与辅酶结合的位点 Asp50 Tyr55 Lys84 His117是催化中心 而额外的保守氨 基酸用以维持三维结构 醛酮还原酶中最主要的变化区域在C端区域 这 对于保证酶的底物特异性非常重要 7 312 醛酮还原酶的催化机制 醛酮还原酶的活性中心通常由酪氨酸Tyr 组氨 酸His 天冬氨酸Asp和赖氨酸Lys这4个氨基酸组 成 但也有例外 如在人类固醇5 2还原酶即A KR1D1 中His替换为Glu 8 而在调控电压门控钾离子通道 的A KR6A3 A KR6A5 A KR6A9中 Asn替 换 了 His 9 在催化中心的4个氨基酸残基中 Tyr是质子 的供体 赖氨酸与天冬氨酸残基的羧基形成盐桥 并与 酪氨酸羟基形成氢键 这样形成的氢键 盐桥可降低 Tyr的p Ka值 促进质子转移 His117因其周围的疏 水环境 能降低咪唑侧链的p Ka值 使其在生理p H 值下较难作为质子供体 Asp的侧链与辅酶的核糖羟 基形成氢键 该残基对于催化过程并不是必要的 水 分子结合在Tyr55 His117和与酶结合的NADP 分 子之间 这样有利于羰基底物的定位 Tyr55 His117 及烟酰胺环形成一个氧阴离子洞 7 在A KR1D1中 替换His的E120主要有两种作用 8 一是使得类固 醇结构复合体均可以插入到活性中心狭洞中 而不至 于被His的咪唑侧链所阻碍 这样反应可以在NAD2 PH的42pro2R氢阴离子 A KR上转移的氢阴离子的 立体化学结构为42pro2R 因此 又称为42pro2R氢阴 离子 8 和类固醇的C5位置之间发生 二是E120与 类固醇的C3酮基产生氢键 且侧链处于反式构象的 E120产生了 酸性 的氧阴离子洞 能使类固醇的C3 烯醇化并促进氢阴离子的转移 8 如图2所示 图2 类固醇5 2还原酶的催化机制 8 Fig 2 Catalytic mechanism of steroid25 2 reductase A KR催化的酶促反应过程为 辅酶NAD P H 先结合到A KR上 接着底物再结合到A KR上 通过 一种 推 拉 机制进行转化反应 待反应结束后 先释 放产物 再释放出氧化态的辅酶 这也许是因为与 NADPH结合 酶的构型才会发生改变 才可以进一步 与底物结合 整个过程中辅酶最先结合到酶 最后从酶 李凌凌等 醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用 2009年第11期 64 上释放下来 属于 Ordered bi2bi机制 5 A KR催化 的还原反应为两步 10 图2 首先将42pro2R氢阴离 子 即带一对电子的质子 从NAD P H上转移到底 物羰基上 然后 质子从酶上的Tyr转移到氧阴离子 中间体 Tyr和Lys之间形成的氢键促进该转移过程 His分子可能参与了质子的转移过程 或者与氧阴离 子形成氢键 从而稳定了该中间体 6 313 醛酮还原酶结合辅酶的方式 大多数的醛酮还原酶都以NADPH作为辅酶 某 些酵母木糖还原酶既能以NADH 也能以NADPH作 为辅酶 11 以Candida tenuis木糖还原酶 CtXR 为 例 其X2衍射结果说明CtXR会针对辅酶含有或不含 有2 2磷酸基团两种情况 诱导出两种不同的酶构型 研究也表明 野生型CtXR虽然可以NADH作为辅 酶 但是更倾向与NADPH结合 而构建的CtXR突 变体 K274突变成R N276突变成D 与野生型 CtXR相比 对于NADH的亲和力要比NADPH高5 倍 另外 Pichia stipitis的NAD P H依赖的D2木 糖还原酶的结构中 与NAD H NADP H 的结合位 点 均是由16个氨基酸形成的亲水性结合口袋 该口 袋与NAD H 结合时 Glu223和Phe236与辅酶形成 的氢键起到至关重要的作用 而与NADP H 结合 时 Lys21和Phe236与辅酶形成的氢键起到作用 12 A KR家族中的成员与辅酶NAD P H的结合方 式几乎一致 都在延伸状态的桶状结构的羧基端 其 中NAD P H的烟酰胺环结合在桶状结构的中心 焦 磷酸横跨酶裂口的两端 在 27和 28折叠之间 而腺 嘌呤单磷酸部分则结合于螺旋 27 28和B2环之间 其中一小部分B2环在辅酶结合后会发生构象变化 将 NADPH的焦磷酸部分锁定在正确的位置 这是整个 反应的限速步骤 对于辅酶的结合和反应最后辅酶的 释放都至关重要 此外 烟酰胺环与Tyr216接触 使 得辅酶能面向活性中心 以保持从42pro2R面进行氢 阴离子转移 在此方向上 烟酰胺环在核糖的反方向 而保持这个方向需要Ser166 Asn167和Gln190与辅 酶的酰胺基团形成氢键 Asp50和Thr24与NADPH 中的核糖相互作用 而焦磷酸骨架与B2环的Leu219 和Ser221之间形成氢键 最终 腺嘌呤2 2单磷酸通 过Arg270 Ser271 Phe272 Arg276 Glu279和 Asn280与酶之间产生广泛的氢键和离子键 以3 2羟 基类固醇脱氢酶为例 见图 3 7 连接第一个 2折叠和第一个 2螺旋的环 称为 12 12环 位于残基33 36 为较大的柔软的辅酶结合 环 又称之为 安全带 在所有A KR家族中 1 2 12 图3 AKR 3 2羟基类固醇脱氢酶 结合辅酶方式 Fig 3 Schematic of NADP binding in the AKRs 环均参与了结合辅酶NADPH 并在辅酶结合后跨越 其上 以确保形成NADPH NADP 核苷酸底物 在 A KR结构中 1 2 12环的构型变化较大 该结构变化对 于确保辅酶的释放是必须的 且被认为是整个反应的 限速步骤 但其氨基酸序列并非保守 6 如兔20 2羟 基类固醇脱 氢 酶 A KR1C5 的 辅 酶 结合 口袋中 His222和Lys270残基侧链形成盐桥 覆盖在辅酶中 心的磷酸链上 即安全带 5 又如大麦醛糖还原酶中 Arg33的N 原子和Glu221及Ser219侧链上的O原 子之间形成氢键 产生 安全带 图4 另外 Ser219 的侧链 Trp32的N原子和辅酶直接作用 而细菌的 2 52二酮基2D2葡萄糖酸还原酶A和Gcy1p均缺少这 个安全带 导致对NADPH的结合情况有所变化 6 13 特别是Gcy1p对NADPH的亲和力较其它醛酮还原 酶要低很多 13 图4 大麦醛糖还原酶结构中的安全带 6 Fig 4 The safety belt ofHordeum vulgarealdose reductase 另外 如果被消耗的NADPH不能很快再次被还 原 NADP 会抑制酶的活性 这是由于醛酮还原酶催 李凌凌等 醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用 2009年第11期 65 化羰基还原反应过程中形成了两个不带电荷的复合 体 一个是酶2Tyr2OH 底物羰基 NADPH 另一个 是酶2Tyr2O 产物醇 NADP 但NADP 过多时 会形成带正电荷的酶2Tyr2OH NADP 复合物 使得 不带电荷的底物不容易进入活性中心 14 314 醛酮还原酶结合底物的方式 醛酮还原酶的结构中 底物结合位点类似于一个 裂缝 包含有三个部分 以3 2羟基类固醇脱氢酶为 例 氧阴离子结合位点 Tyr55 His117和烟酰胺环的 C4部分 在活性中心位点边缘的残基 Ala52 Leu54 Trp86和Phe118 来自于三个环的氨基酸形成裂缝 的边缘 首先A2环 Met120 Phe128和Phe129 形成 非极性的裂缝的一边 B2环 Trp227 和羧基端的环 Asn306 Ala308以及 Tyr310 形成另一边 7 底物 结合口袋中有些部分是保守的 如活性中心的Tyr和 His 活性中心附近的Ala52和Trp86 有些则是可变 的 醛酮还原酶家族的底物特异性较为广泛 包括醛 糖的醛基 脂肪族和芳香族的醛基 脂肪族和芳香族的 酮基 其活性中心边缘的残基会根据不同大小的底物 调整结合位点的拓扑结构 以区别这些底物分子 不 同A KR的桶状结构羧基端的三个环的组成和大小也 有所区别 说明它们决定着底物特异性 这些环还决 定了HSD还原反应的位置特异性和立体结构特异 性 譬如 在鼠肝3 2 HSD中 类固醇的 2面定位朝向 A2环 使得类固醇的C3羰基结合在活性中心 在17 2 HSD中 类固醇从反向结合 其 2面定位朝向A2环 使得类固醇的C17位朝向活性中心 而20 2 HSD中类 固醇底物只能从反向结合 这些底物结合模式的不同 决定于这些酶中A2环的不同 3 2 HSD中A2环上的 Phe128和Phe129 在17 2 HSD中被分别替换成了 Tyr和Leu 而在20 2 HSD中被替换成了两个Leu 这些发生变化的残基均保留了结合位点的非极性特 征 但同时也产生了类固醇特异性的范德华力作用 从 而产生位置和立体特异性的反应 当然 在非极性裂 缝另一头的B2环和C2环 在不同的HSD中也存在特 异性 另外 羧基端的环也能区别糖和类固醇 并确定类 固醇特异性 在ADR的环中残基306 308和310是 高度保守 为Cys2Leu2Ser 在哺乳动物醛还原酶中 这 些残基都变为Ile2Pro2Leu Ile 在植物的ALR中这些 残基又变化为Leu2Gly2Glu 醛糖还原酶和醛还原酶 在306残基上发生的突变 会影响其对许多底物的催 化效率 7 4 醛酮还原酶的生理作用 大多数醛酮还原酶的生理作用还不清楚 目前主 要采用以下方法来确定醛酮还原酶的生理作用 1 建 立酶基因的缺失突变体 如将酿酒酵母的1个或2个 A KR基因打断 菌株仍显示正常表型 但将至少3个 A KR基因打断 就会出现热休克表型 并且在缺乏纤 维醇的培养基上生长缓慢 由此表明A KR基因的打 断会导致氧化压力标记的提高和纤维醇营养缺陷 15 在酿酒酵母中 敲除A RA 1 现命名为A KR3C 基因 后 菌株没有检测到D2型树胶醛糖脱氢酶活性及其对 应产物 由此推测此基因编码的就是D2阿拉伯糖脱氢 酶 16 同 法 推 断 酿 酒 酵 母 中Y PR 1 现 命 名 为 A KR3A 2 具有22甲基丁醛还原酶活性 17 2 过量 表达酶的基因 如在酵母细胞中Gre3P的过量表达 能使细胞对甲基乙二醛的耐受性提高 18 在大肠杆菌 中异源过量表达A KR14A1 能使细胞免受二羰基的 毒害 说明这个酶可能在菌体内参与了二羰基这种化 合物的解毒代谢 19 3 从调节方式上推测酶的功 能 如 酿 酒 酵 母 S acchromyces cerevisiae 中 的 GR E3基因 现命名为A KR2B 6 是由渗透压诱导产生 的 20 GR E3的mRNA在具有过氧化氢和离子压力 如LiCl 的条件下 在两阶段生长漂移点被诱导出 来 说明醛酮还原酶在代谢调节和对环境中压力应答 方面有很大的作用 4 在生物合成的基因簇中与其 它基因的共调节共表达 如红霉素和泰乐菌素合成过 程中的糖基化过程 糖多孢红霉菌 S accharopolys2 pora erythraea 中eryB 基因编码的氧化还原酶 现 命名为A KR12B 是红霉素合成基因簇中的一部分 此基因缺失的突变体会积累NDP242酮基262脱氧2D2葡 萄糖这种代谢中间产物 分析此基因在基因簇中所处 的位置 可推测其作用是还原NDP242酮基262脱氧2D2 葡萄糖成相应的L型产物 5 加入酶的抑制剂 如 在过量表达A KR1C3的内皮细胞中加入酶抑制剂吲 哚美辛等预处理后 再加入9 102菲醌 可以抑制因9 102菲醌诱导的还原型谷胱甘肽水平降低 这显示 A KR1C3是在人类的主动脉内皮细胞中9 102菲醌诱 导产生细胞毒性的起始阶段的重要酶 21 5 醛酮还原酶在不对称合成手性醇方面的应 用 511 醛酮还原酶在 2羰基不对称还原方面的应用 醛酮还原酶可应用于 2羰基不对称还原 例如 醛酮还原酶可催化42氯232羰基乙酸乙酯 Ethyl 42 李凌凌等 醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用 2009年第11期 66 chloro232oxobutanoate COBE 不对称还原成 R 2或 S 242氯232羟基丁酸乙酯 Ethyl 42chloro232hydroxy2 butanoate CHBE 而 R 2或 S 2CHBE可用于合成 L2肉碱 HMG2COA还原酶抑制剂等 是有机合成中 重要的中间体 从许多微生物中分离到的醛酮还原酶 都具有还原COBE的活性 且都有较高的ee值 以掷 孢酵母 S porobolomyces salmonicolor A KU4429为 例 22 23 从中分离出了三类醛还原酶 AR AR 和 AR AR 是组成型表达蛋白 占细胞总蛋白重的 415 AR 和AR 在细胞中的含量不到AR 的 1 AR 现已实际应用于 R 2CHBE的不对称合 成 丙酮抽提的AR 与葡萄糖脱氢酶 Glucose de2 hydrogenase GDH 在水相中不对称合成 R 2CHBE 产率为80 ee值为84 AR 可将CAAE还原成 S 2CHBE ee值为93 还可还原脂肪族和芳香族 醛 但不能以醛糖作为底物 AR 不对称还原形成的 产物是 R 2CHBE ee值只有38 512 醛酮还原酶在 2羰基不对称还原方面的应用 醛酮还原酶也可应用于 2羰基的不对称合成 Ishihara等 24 和Yamaguchi等 25 从 嗜 热 放 线 菌 Streptomyces thermocyaneoviolaceus IFO14271中 相继分离出三种 2酮酯酶STKER2 STKER2 STKER2 STKER2 酶可专一地催化脂肪族和芳 香族 2酮酯 生成的产物都是 S 2醇 ee值都超过了 99 该酶具有高度的稳定性 在有机溶剂和表面活性 剂中也比较稳定 STKER2 酶的最适p H值为710 1010 STKER2 的最适p H值为515 910 这三 种酶都可以还原32甲基222羟基丁酸乙酯 Ethyl 32 methyl222oxobutanoate STKER2 酶的还原产物为 S 2醇 而STKER2 和STKER2 酶还原生成的是 R 2醇 ee值都较高 STKER2 酶对体积大的底物 的还原均具有高度的立体选择性 而STKER2 酶仅 对32甲基222羟基丁酸乙酯有较高的立体选择性 而对 其它底物立体选择性较低 研究还发现 反应温度对 产物的立体化学性影响较大 如催化32甲基222羟基丁 酸乙酯时 37 时产生 R 2醇 60 时产生 S 2醇 513 异源表达的醛酮还原酶在不对称合成手性醇方 面的应用 随着基因工程技术的发展 国内外一些学者纷纷 尝试构建基因工程菌来异源表达A KR 并应用于不对 称合成手性醇 譬如 异源表达青霉菌 Penicillium citrinum IFO4631 26 中的一种 2酮酯还原酶 命名为 A KR3E1 的重组大肠杆菌 可在水相 乙酸丁酯两相 体系中 还原42溴232羰基甲基丁酸 Methyl 42bro2 mide232oxobutyrate BAM 生成合成HMG2COA还 原酶抑制剂的重要中间体 S 242溴232羟基甲基丁酸 Methyl S 242bromo232hydroxybutyrate S 2BH2 BM 其在有机溶剂中的产率可达277 mmol L 1 即 54 mg mL 1 而ee值为9719 Kataoka等 23 通 过克隆来自掷孢酵母的醛还原酶基因而构建重组菌 用于还原42氯乙酰乙酸乙酯 在水 有机两相中还原 生成 R 2CHBE ee值为9117 Itoh等 26 在大肠杆 菌中异源表达A KR3E1 研究了这个重组的大肠杆菌 对BAM COBE的不对称还原能力 发现在单一相系 统和水 有机两相系统中 不对称还原BAM生成 S 2 BHBM ee值分别为9613 和9719 不对称还原 COBE生 成 S 2CHBE ee值 分 别 为6117 和 6610 Jing等 27 构建了重组菌并还原COBE 发现 重组菌的酶活是从掷孢酵母直接纯化的酶的15倍 产 率为9815 ee值为99 6 结语 醛酮还原酶是一类具有羰基还原功能的超家族 种属范围广泛 其家族成员均具有 8桶状结构 有 着保守的催化机制 而底物结合口袋有一定的变化 了解已知A KR的结构和作用之间的关系 可为酶的 理性设计提供有用的信息 哺乳动物A KR中存在潜 在的药物靶点 可利用这些蛋白的相似性 设计针对酶 的特异性抑制剂 虽然A KR的催化机制和NADPH 结合模式已经阐明 但这些蛋白究竟如何区别糖和类 固醇 如何获得不同类固醇的位置和立体结构特异性 还有待于进一步研究 此外 A KR家族的结构和作用 之间关系的研究 能提供有关此酶底物特异性的进化 信息 并了解这些酶如何利用相同的反应框架 针对广 泛的底物进行相似的反应 因此将来可能会利用这一 A KR框架 用于改造桶状结构的羧基端环 从而产生 新的底物特异性 再者 大多数A KR家族成员的生理功能尚不明 晰 虽然可通过基因缺失 异源表达以及表达模式研究 等方法 来推测这些酶在细胞代谢过程中的作用 但直 接考察生理条件下酶活的方法还是非常需要的 如通 过克隆和表达那些与已知A KR的开放阅读框相似的 ORF来确定这些可能的酶及其活性 以及利用基因组 微阵法来掌握未知A KR的ORF调节信息从而了解 未知酶的生理作用等 这些方法均是今后研究A KR 生理活性的重要方向 最后 许多A KR都已经广泛应用于生物转化 相 信该超家族在生物催化方面 有着更为广泛的产业化 李凌凌等 醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用 2009年第11期 67 前景 参考文献 1 Ellis E M Microbial aldo2keto reductase J FEMS Microbiolo2 gy Letters 2002 216 2 1232131 2 Hyndman D Bauman D R Heredia V V et al The aldo2keto reductase superfamily homepage J Chemico2Biological Interac2 tions 2003 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35 3 2032215 下转第90页 王旭东等 高效液相色谱法检测产绿链霉菌发酵液中肥拉霉素A的含量 2009年第11期 90 表1肥拉霉素A的回收率 Tab11The recovery rate of avilamycin A 样品量 g加入量 g测得量 g回收率 23 523053 4699 80 23 523053 3899 53 23 524063 71100 48 23 524063 77100 62 23 525073 61100 18 23 525073 63100 22 平均回收率 100 14 RSD 0 41 提取1 h后 处理样品 用丙酮 磷酸盐缓冲溶液 体 积比7 3 重溶进行液相色谱检测 色谱条件 乙腈 012 g mL 1 磷酸二氢铵溶液 p H 值310 50 50 为流动相 流速为1 mL min 1 检测波长为214 nm 肥拉霉素A浓度在10 80 g mL 1范围内与 峰面积线性关系良好 加样平均回收率为100114 RSD为0141 本方法简便有效 重复性好 可作为产绿链霉菌发 酵液及其相关产品中肥拉霉素A含量的检测方法 参考文献 1 Weitnauer G M hlenweg A Trefzer A et al Biosynthesis of the orthosomycin antibiotic avilamycin A Deductions from the molecular analysis of theavibiosynthetic gene cluster ofStrepto2 myces viridochromogenesT 57 and production of new antibiotics J Chem Biol 2001 8 6 5692581 2 陈永辉 刘波 阿维拉霉素的研究进展 J 饲料工业 2007 28 14 9211 3 李桂杭 李浩明 HPLC法测定红曲霉发酵液中洛伐他汀含量 J 广东药学院学报2008 24 3 2292230 4 靳亮 童应凯 王泽立 等 卑霉素高产菌株的选育 J 中国抗生 素杂志 2006 31 5 3032305 5 张秀英 阿维拉霉素预混剂的含量测定 J 中国兽药杂志 2000 35 3 21223 Determination of Content of Avilamycin A in Fermentation Broth ofStreptomycesp T 57 by HPLC WANG Xu2dong ZHAO Jing2guo School of Biology and Pharmaceutical Engineering W uhan Polyte