糖尿病动物模型综述讲解.ppt

糖尿病动物模型综述 13级民族药物化学李波 引言 糖尿病 diabetesmellitus DM 属中医学消渴范畴 是以多饮 多食 多尿 身体消瘦 或尿浊 尿有甜味为特征的疾病 现代医学认为 糖尿病是一种由多种病因引起的慢性代谢性疾病 是由于体内胰岛素缺乏 或拮抗胰岛素的激素增高 或胰岛素在靶细胞内不能发挥正常生理作用而引起葡萄糖 蛋白质及脂质代谢紊乱的综合征 临床上分为胰岛素依赖型糖尿病 IDDM 即1型和非胰岛素依赖型糖尿病 NIDDM 即2型两种类型 为探清糖尿病病因 建立理想的DM动物模型是十分必要的 动物模型也可以筛选降糖药物 可以为中医药治疗糖尿病提供实验依据 人类疾病的动物模型 animalmodelofhumandisease 是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物 原则 相似性 重复性 可靠性 适用性和可控性 易行性和经济性 注意事项 1 注意模型要尽可能再现所要求的人类疾病 2 注意所选用动物的实用价值 3 注意环境因素对模型动物的影响 4 不能盲目地使用近交系动物 不然会导致不能控制的因素进入实验 5 动物进化的高级程度并不意味着所有器官和功能接近于人的程度 6 正确地评估动物疾病模型 目前 DM动物模型主要分为3类 药物诱发性DM动物模型 自发遗传性DM动物模型和转基因DM动物模型 1药物诱发的DM动物模型 化学药物诱导法是指运用化学药物损伤胰岛B细胞导致胰岛素缺乏而引起实验性糖尿病 是应用于药理学研究的经典方法 化学药物诱导的糖尿病具有发病率高 造模时间短 发病时间整齐和病情的严重程度较统一等优点 常用的药物有四氧嘧啶和链脲佐菌素 1 1四氧嘧啶诱发dm 四氧嘧啶 Alloxan 是一种特异的胰岛细胞毒剂 可选择性地损伤多种动物的胰岛B细胞 引起实验性糖尿病 它常用于制备1型糖尿病动物模型 造模方法 给动物一次性静脉或腹腔注射1 5 的Alloxan水溶液100 200mg kg 机制 Alloxan是自由基活性剂 其所产生的H2O2等负离子自由基能选择性地直接损伤胰腺 细胞的DNA 引起胰腺 细胞的死亡 胰岛素合成受阻 引起高血糖 优点 用药量少 操作方法简便且价廉 由血浆半衰期仅1 2min 故能快速成模 且注射速度越快成模率越高 缺点 大剂量的Alloxan可致动物酮症酸中毒而死亡 可致肝 肾组织中毒性损害 因此 使用Alloxan制备糖尿病模型时要严格控制剂量 注意事项 Alloxan水溶后不稳定 应现用现配 1 2链脲佐菌素 streptozocin STZ 诱发dm STZ是一种药效强大的烷化剂 能干扰葡萄糖的转运 影响葡萄糖激酶的功能 诱导DNA双链的断裂 造模方法 1 迟发型 大鼠第1天腹腔注射福氏佐剂015mL 次日按25mg kg腹腔注射STZ溶液 每周1次 连续3周 此模型接近人类1型糖尿病 2 速发型 动物喂以高糖高脂饲料1 2个月 诱导出胰岛素抵抗后 按25 30mg kg腹腔注射STZ 一周后断尾取血测空腹血糖或口服葡萄糖耐量试验 给糖调节受损动物 继续饲高糖高脂饲料可出现高血糖症 尿酮尿酸症和 三多一少症状 进而发生白内障 糖尿病性心脏病 糖尿病性肾病等并发症 此模型适用于人类2型糖尿病的研究 1 2链脲佐菌素 streptozocin STZ 诱发dm 机制 STZ引起糖尿病的机制可能通过以下途径 1 STZ直接破坏胰岛 细胞 首先将其DNA碱基上的特殊位点烷基化后 进一步作用于ADP核糖体合成酶 从而损伤胰岛 细胞 使 细胞数量明显减少 残存的 细胞几乎完全脱颗粒 胰岛素合成和分泌减少 引起糖代谢紊乱致血糖升高 2 通过NO和自由基途径损伤胰岛 细胞 STZ是一种含亚硝基的化合物 可以诱导NO的合成 增加对胰岛 细胞的氧化侵袭而特异性破坏胰岛 细胞 优点 STZ对组织毒性小 诱发动物糖尿病模型成功率高 且一般不表现自发性缓解 缺点 STZ剂量过大易导致动物死亡 因多尿 高糖 体重明显减轻 故体重较轻的动物易死亡 注意 利用STZ造模时应控制剂量 STZ必须4 保存及新鲜配制 1 3Alloxan STZ联合给药诱发dm 造模方法 Alloxan和STZ用50mmol L无菌枸橼酸钠缓冲液 pH 415 分别配成200mg mL和120mg ml的溶液 实验动物禁食24h后 氯胺酮麻醉下行股静脉穿刺 留置导管 经导管分别注入上述浓度的Alloxan50mg kg和STZ30mg kg 给药后24h血糖升高 48h后血糖 11 1mmol L且持续两周维持在此高血糖水平 机制 Alloxan和STZ都能通过其毒性作用选择性破坏胰岛 细胞 使胰岛素分泌减少 从而诱导实验动物的糖尿病状态 优点 两药合用 减少二者剂量 既降低了由于单用Alloxan对肝 肾的损害 又弥补了单用STZ剂量过大而致动物死亡或剂量过小而致成模率低的不足 注意事项 两药诱导后10h左右可出现急性低血糖反应 故给药后应在第8 10 13h经皮下注射补充一定量的葡萄糖 以预防发生致命的低血糖 1 4肾上腺素 AD 诱发dm 造模方法 小鼠皮下注射AD240ug kg 给药后135min从小鼠眼底静脉丛取血测血糖 如未完全出现高血糖 应追加注射1次AD 直到出现糖尿病症状 机制 AD进入体内促进肝脏及肌肉糖原分解 肌肉中糖酵解生成的乳酸增多 经三羧酸循环糖异生增快 同时激活丙酮酸羧化酶 使丙酮酸向磷酸烯醇式丙酮酸转化促进糖异生 导致血糖升高 优点 使用肾上腺素建立模型简单 易行 灵敏度高 缺点 AD造模所测定的血糖不完全是葡萄糖 专一性不强 除AD外 地塞米松2mg kg连续肌肉注射可以造成小鼠葡萄糖耐量下降模型 2自发性糖尿病动物模型 自发性糖尿病动物模型是在自然条件下动物自然产生 或由于基因突变而出现类似人类糖尿病表现的动物模型 实验动物未经任何有意识的人工处理 在自然状态下发生的以高血糖 胰岛素抵抗为主要特征的动物模型 该模型更接近人类糖尿病的自然起病及发展 尤其适于研究糖尿病的病因学 但自发性糖尿病动物因其来源相对较少 饲养 繁殖条件要求高 动物昂贵等缺点限制了其在科学研究中的应用和普及 2 1啮齿类自发dm动物模型 目前 人们筛选成功并能够作为种系保存下来的自发性的糖尿病动物模型主要是啮齿类动物糖尿病模型 大多数自发性的糖尿病模型为基因缺陷型或易感型自发糖尿病鼠 但最终发展为1型糖尿病 主要包括有 Diabetes DB 小鼠 Obese OB 小鼠 Toronto KK T KK 小鼠 NagoyaShibataYasuda NSY 小鼠 Biobreeding BB 大鼠 ZuckerDiabetesFatty ZDF 大鼠 Goto Kakizaki GK 大鼠 OtsukaLong EvansTokushimaFatty OLETF 糖尿病大鼠等 2 1 1KK Ay小鼠 KK小鼠是日本学者培育的一种轻度肥胖型2型糖尿病动物 后与C57BL 6J小鼠杂交 并进行近亲繁殖 得Toronto T kk 小鼠 将黄色肥胖基因 即Ay 转至KK小鼠 得KK Ay鼠 与KK小鼠相比 有明显的肥胖和糖尿病症状 从5周龄起 血糖 血循环中的胰岛素水平以及HbA1c水平逐步升高 细胞有脱颗粒和糖原浸润 随后出现胰岛肥大和中心气泡 肝脂肪化和脂肪组织增多 脂肪组织的胰岛素敏感性降低比KK小鼠明显 且到16周龄时完全丧失 肾脏病变发生早 发展迅速 肾小球基底膜增厚 用KK Ay鼠可评价抗糖尿病药物的胰腺外作用 2 1 2NOD小鼠 NOD小鼠 nonobesediabetesmouse 是JCL ICR品系小鼠衍生的CTS 白内障易感亚系 糖尿病小鼠近亲杂交而来 其发病多突然 表现明显多饮 多尿 消瘦 血糖显著升高 不用岛素治疗 动物存活不了一个月 通常死于酮血症 NOD小鼠是自发性自身免疫I型糖尿病的一个很好的模型 是由T 细胞 包括CD4和CD8细胞 介导的 其发展受控于一系列T细胞的调节 细胞损伤继发于自身免疫过程 引起低胰岛素血症 免疫调节剂 可溶性白介素 1受体 可溶性TNF受体p55 高果糖饮食等可预防NOD小鼠糖尿病发作 NOD小鼠的糖尿病发病率与性别有关 雌性鼠发病率显著高于雄性鼠 且发病早 2 1 3NSY小鼠 NSY Nagoya Shibata Yasuda 小鼠是一近交系自发性糖尿病模型 是从远交JCL ICR小鼠中选择糖耐量异常株培育而成的 其糖尿病发生具有年龄依赖性 24周龄时胰岛素分泌功能严重受损 48周的累积发病率雄性为98 雌性为31 此鼠在任何年龄阶段都不表现严重肥胖和显著的高胰岛素血症 胰岛也无肿大或炎性变化 胰岛 细胞分泌胰岛素功能受损和胰岛素抵抗可能是NSY小鼠发生NIDDM的机制 与人的NIDDM发病机理相似 2 1 4BB糖尿病大鼠 是从Wistar大鼠中筛选出来的一种自发性 遗传性1型糖尿病动物模型 其发病和自身免疫性毁坏胰腺 细胞引发胰腺炎及胰岛素缺乏有关 大鼠糖尿病发作是突然的 大约在60 120日龄时发病 数天后 糖尿病动物出现严重的高血糖 低胰岛素和酮血症 免疫抑制剂 将新生鼠胸腺切除等可预防糖尿病的发生 说明自身免疫参与发病 2 1 5中国地鼠 中国地鼠 Chinesehamster 亦称黑线仓鼠 其自发性遗传性糖尿病史最早由美国的Meier和Yer ganign将健康中国地鼠通过近亲繁殖而成的近交系品种 为非肥胖型 轻 中度高血糖 初发病时 酮尿症发生率 血糖 血浆胰岛素 胰高血糖素和葡萄糖水解酶水平恒定降低而胰高血糖素恒定升高 类似于人类 型糖尿病 自发性NIDDM近交系中国地鼠 KDS 是日本东京医科大学动物实验中心培育糖尿病模型动物 其NIDDM主要发生于雄性地鼠 发病突然 2月龄发病率为50 6月龄发病率达80 以上 临床表现为多食 多饮 多尿 血糖和糖尿浓度急剧上升 但在无外源性胰岛素治疗条件下仍能存活 并且其心 肾慢性血管病变的病理学特征也与人类糖尿病慢性血管病变相似 因此中国地鼠自发性糖尿病可作为研究 型糖尿病及其并发症的良好的动物模型 2 2其他动物自发模型 NIDDM猫科动物与人类NIDDM的临床症状有80 的相似 显著的特征是也好发于中老年阶段 其胰岛素抵抗和肥胖作为糖尿病发生的早期症状 自发的猪NIDDM模型 主要有2个品种 尤卡坦小型猪和哥廷根小型猪 其中尤卡坦小型猪的一种品系表现为糖耐量增高 另一品系则表现为糖耐量受损 哥廷根小型猪给予高脂高能食物后 成为代谢综合征的理想模型 所有种类的动物模型中 在非人灵长类动物模型中所观察到的血糖规律 病理特征与在人类糖尿病患者中所观察到的临床特征最为相似 自发性的糖尿病在食蟹猴 恒河猴 冠毛猴 台湾猴 豚尾猴 西伯里斯岛猴 非洲绿猴以及狒狒等非人灵长类动物中均有发现和报道 3转基因糖尿病模型 转基因动物技术是20世纪80年代初发展起来的生物高新技术 对生命科学的发展起到了重大的推动作用 总的来说 有两种方法 1 传统的转基因方法 即新基因信息的转入和在动物体内的表达 2 基因打靶方法 即将特定的内源性基因断裂或以其他基因代替 3 1转基因动物模型和基因敲除动物模型 转基因技术是指研究者按照自己的意愿 借助于实验手段来控制实验动物的特定基因组及其表达等 使动物表现特有的遗传性状 转基因动物模型采用的哺乳动物和人的基因组有很大的同源性 但来源于人的外源蛋白在动物体内由于作用环境的差异 可能会造成功能的差异而导致没有出现相应的模型性 基因敲除是利用基因同源重组原理 采用突变的外源DNA片段整合入受体细胞的DNA同源序列中取代某一特定基因 从而获得基因型发生改变的转基因动物 以研究靶基因的体内功能或相关疾病的致病机制 为研究单个蛋白在胰岛素信号传导中的作用提供了重要手段 同时显示了胰岛素分泌作用的轻微缺陷也能导致糖尿病 但很难揭示胰岛素抵抗和糖尿病发生的根本机制 常见的转基因或基因敲除动物包括与胰岛素和胰岛素受体以及胰岛素下游信号元件相关基因 如 IRS 1 IRS 2 GLUT 4 PTP 1B等基因敲除小鼠 PPAR 组织特定基因敲除小鼠 葡萄糖激酶 GK 或GLTU 2基因敲除小鼠 肝脏特异性胰岛素受体基因敲除小鼠 iL IRKO 细胞特定基因敲除小鼠 sqstm1基因敲除 OK 小鼠 骨骼肌特异性LPL SMLPL 基因敲除小鼠 IRS 1 IRS 2双基因敲除小鼠 IRS 1 GK 双基因敲除小鼠 人胰岛淀粉样蛋白多肽过度表达大鼠 GIPR dn 转基因小鼠 下丘脑脑源性神经营养因子 BDNF 转基因小鼠模型等 3 2举例 GK IRS 1双基因剔除小鼠 2型糖尿病有两个主要特征 周围胰岛素抵抗和 细胞分泌胰岛素功能受损 轻度胰岛素抵抗和胰岛素分泌功能轻度缺陷的小鼠 杂交后后代可产生2型糖尿病症状 GK IRS 1双基因剔除小鼠 IRS 1 小鼠表现为胰岛素抵抗 但由于B细胞代偿性增生 胰岛素分泌增多 糖耐量正常 细胞特异GK表达降低的小鼠 显示轻度糖耐量异常 两者杂交产生的GK IRS 1双基因剔除小鼠 表现2型糖尿病症状 既有胰岛素抵抗又有糖耐量异常 医学定义 胰岛素抵抗 InsulinResistance IR 指的是正常量的胰岛素起不到正常的降低血糖的作用 体内组织对于胰岛素的作用不敏感 糖耐量 通俗地说就是人体对葡萄糖的耐受能力 GDM 妊娠糖尿病 模型 妊娠期胰岛素抵抗可引起妊娠糖尿病 患者胎儿典型特征是巨大 而成年后患肥胖和2型糖尿病的概率上升 杂合体Leptin受体缺乏 Leprdb 小鼠发生GDM症状 其子代特征与GDM母亲所生胎儿症状相似 杂合体C57BLKsJ db 小鼠也发生GDM 妊娠引起PI3K与IRS 1解离 与IR结合活性增加 胰岛素介导的精氨酸磷酸化增多而IRS 1表达及其酪氨酸磷酸化减少从而使IRS 1结合及激活PI3K能力下降 胰岛素功能不能发挥 出现胰岛素抵抗 4其他dm动物模型 4 1胰腺切除法造糖尿病动物模型此法是最早的糖尿病动物模型复制方法 1890年Mehring和Minkowski报道 在切除狗的胰腺后 狗会出现多尿 多饮 多食和严重的糖尿现象 实验一般选用较大的动物 如狗和家兔等 其次用大鼠 切除实验动物的全部胰腺 可制成无胰性糖尿病动物模型 需补充外源性胰酶 如果希望动物保持良好的健康状况 需保留部分胰腺组织 艾昭东等在无菌操作下切除实验动物胰腺组织90 左右喂养一段时间后 可成为1型糖尿病模型 胰腺切除90 92 3 的动物比文献报道切除70 90 的动物成模时间更短 更稳定 具有手术并发症较少 动物成活率高