对β-内酰胺类抗生素高分子聚合物质控现状的分析及相关问题思.doc

对内酰胺类抗生素高分子聚合物质控现状的分析及相关问题思考CDE审评三部 张昕 成海平【摘要】本文综述了内酰胺类抗生素高分子聚合物测定的国内外研究进展，介绍了聚合物测定的原理和具体方法，分析了目前在聚合物测定中存在的问题，并针对问题提出了处理建议。 【关键词】高分子聚合物、质控现状、测定方法 1、概述 抗生素是临床用量最大和较易发生不良反应的药物。其中最常见的一类不良反应就是过敏反应。多年来的研究已证明，在内酰胺类抗生素所致的速发型过敏反应中，药物分子本身只是半抗原，药物中存在的高分子聚合物才是引发速发型过敏反应的真正过敏原，因此严格控制抗生素中高分子聚合物的含量有着重要的意义。 本文综述了高分子聚合物测定方法在国内外的研究进展，对实际测定过程中遇到的问题作简单的分析和探讨。 2、高分子聚合物的分类 抗生素中的高分子杂质系指药品中分子量大于药物本身的杂质总称，其分子量一般在10005000Da，个别可达10000Da左右。内酰胺类抗生素中的高分子杂质按其来源通常被分为两类：外源性杂质和内源性杂质。 外源性杂质包括蛋白、多肽、多糖等类杂质或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的结合物，来源于发酵工艺，如青霉素中的青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等。 内源性杂质是指抗菌药物的自身聚合产物，聚合物既可来自生产过程，又可在储存中形成，甚至在用药时也可产生。对于现在的生产工艺，外源性的高分子杂质已经较少产生，对内源性聚合物的控制是当前抗生素高分子杂质质量控制的重点。 金少鸿等人的研究1表明，高分子聚合物不仅能引发IgE介导的过敏反应，而且青霉素类的抗生素还能经胃肠道吸收而引发过敏反应。故对内酰胺类抗生素中的高分子聚合物进行严格的控制，可以保证临床用药的安全有效。 3、高分子聚合物的质控现状分析 3.1 对中国药典近年来收载品种的分析 为了对-内酰胺类抗生素药物中的高分子聚合物进行有效控制，中国药典对收载的部分品种进行了聚合物质控，具体如下： 表1、中国药典2005年版收载的测定高分子聚合物的相关品种 从表1可知，2005年版药典增订品种中除了头孢类外，以青霉素类的药物为主，这改变了2000年版药典中青霉素类药物无高分子聚合物检查的情况。从分子结构上来说，青霉素类的药物其实更容易发生聚合情况，因此，在2005年版药典中增加了对青霉素类药物的高分子聚合物质量控制。 3.2对国外药典收载品种的分析 美国药典23版曾收载了头孢他啶中高聚物的含量测定，检测方法为HPLC外标法，但由于高分子杂质具有高度不均一性和不确定性，无法制备出具有固定含量的对照品等原因，目前USP 24版已不再收载。英国药典中至今未有收载相关品种。 比较国内外药典，可以发现目前国外对于高分子聚合物的控制仍然没有明确的药典方法，这主要是由于高分子聚合物的对照品难以制备，中国药典收载的自身对照外标法定量测定-内酰胺类抗生素中高聚物的检测方法，通过两种流动相的转换，以药品自身对照品取代高分子杂质对照品对-内酰胺类抗生素中的高聚物进行检测，在一定程度上解决了国外无法解决的问题，在某种意义上填补了一项空白，为高分子聚合物的检测指出了一个新的方向。 4、高分子聚合物的测定原理、测定方法及问题讨论 关于高分子聚合物的测定方法，国内外已有许多报道，主要的方法是色谱法。其分离模式有三类：（1）反相模式；（2）离子交换模式；（3）凝胶色谱模式。由于结构不同的高分子杂质通常具有相似的生物学特性，故在药品质量控制中只需控制高分子杂质的总量，就能达到控制致敏物质的目的。因此，根据分子量差异进行分离的凝胶色谱模式是简便易行的分离模式。胡昌勤等人开发了一个以葡聚糖凝胶Sephadex G-10为基础的凝胶色谱分析方法2，可方便地用于对各种内酰胺类抗生素中高分子杂质的分离和分析。 4.1 凝胶色谱分析方法的原理 在Sephadex G-10凝胶色谱系统中，由于Sephadex G-10的排阻分子量仅为700d，因此，除部分寡聚物外，内酰胺类抗生素中的高分子杂质在色谱过程中均不保留；即所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰，其Kav0。在特定条件下，内酰胺类抗生素由于分子间的氢键、静电相互作用、疏水相互作用等次级相互作用，可以形成缔合物，导致其表观分子量增大；此时在Sephadex G-10凝胶色谱系统中和高分子杂质具有相似的色谱行为，即在Kav0处表现为单一的色谱峰。利用此原理，在Sephadex G-10凝胶色谱系统中，以药物自身为对照品，测定其在特定条件下缔合时的峰响应指标；再改变色谱条件，测定样品中的高分子杂质和药物分离后在Kav0处的峰响应指标；按外标法计算，即得药品中的高分子杂质相当于药品本身的相对含量。 4.2 测定方法 通常的凝胶色谱分离系统采用两种流动相，流动相A为pH=7.0的磷酸盐缓冲液，流动相B为纯化水或0.1十二烷基硫酸钠；凝胶介质：Sephadex G-10；检测波长254nm；对照溶液采用自身对照品配制。 （1）系统适用性试验 用蓝色葡聚糖2000的溶液（1mg/ml）作为参比溶液，测定在流动相A、流动相B中的Kav=0的保留时间，并计算出理论板数及拖尾因子。 系统适用性试验中规定，在两种流动相系统中蓝色葡聚糖2000峰的保留时间比值应在0.931.07之间，对照溶液主峰和供试品溶液中聚合物峰与相应色谱系统中蓝色葡聚糖2000峰的保留时间的比值均应在0.931.07之间。 （2）方法学验证 线性关系考察：制备系列的对照溶液，浓度范围为规定浓度的20200，共制备7份样品，以测得的峰面积与溶液浓度进行线性回归，分析是否呈线性。 最低检测限与测定量（浓度）：把已知低浓度的试样测得的信号与空白样品测得的信号比较，计算出能被可靠测出的最低浓度或量，一般以信噪比3：1相应浓度确定最低检测限，以检测限103的量或浓度作为测定量（浓度）。 F值测定的重现性考察：F值为对照溶液的浓度（mg）与测得的峰面积的比值，要求日内、日间的相对标准偏差在5以内。 供试品溶液的浓度与聚合物测定结果的相关性考察：制备系列的供试品溶液，浓度范围为规定浓度的50200，共三份样品，以测得的高聚物峰面积对溶液浓度进行线性回归，相关系数r应大于0.99。 聚合物测定结果的重现性：同批样品，重复测定6次，考察日内与日间的重现性。 4.3 实验中常见问题分析及解决方法 （1）对照溶液主峰的拖尾：在以纯水为流动相的色谱过程中，除缔合分子由于次级相互作用可导致缔合外，一些-内酰胺类抗生素和葡聚糖凝胶间也存在一定的相互作用，因而导致缔合峰严重拖尾，因此若在流动相中加入适当的抑制剂，可改善缔合峰的拖尾。根据胡昌勤等人的研究2，在流动相中加入0.5的葡萄糖溶液或0.01mol/L的甘氨酸溶液替代纯水作为流动相可以明显改善缔合峰的拖尾现象。 （2）对照溶液主峰保留时间与蓝色葡聚糖2000峰保留时间不一致：在实际操作中，出现某些品种对照溶液主峰保留时间与蓝色葡聚糖2000峰保留时间的比值超过1.07，如头孢拉定，原因可能是Sephedex G-10对头孢拉定有一定吸附作用。在使用含0.2mol/L氢氧化钠和0.5mol/L氯化钠的溶液冲洗凝胶柱过夜后，用水冲洗至中性，可改善上述保留时间不一致的状况。 （3）阿莫西林品种的对照溶液不能满足系统适用性要求：系统适用性试验项下要求对照溶液连续进样5次，其峰面积相对标准偏差不大于5.0。阿莫西林对照溶液在进样过程中峰面积越来越小，峰高逐渐降低，峰宽逐渐增宽，RSD一般都会超过5.0，日间重复的RSD也不能符合要求。把流动相B由水改为0.01SDS溶液与0.5葡萄糖溶液，也表现出相同的色谱行为。推测该现象的原因与阿莫西林分子结构有关。可以考虑采用母核结构与阿莫西林相似的青霉素对照品来取代阿莫西林对照品，并加校正因子计算结果。 （4）青霉素V钾的高分子聚合物测定方法的不完善 在中国药典2005年版收载的青霉素V钾质量标准中，以254nm为青霉素V钾的检测波长，而青霉素V钾的最大吸收波长其实在236nm，在实际测量中，基于目前国内的高分子杂质测定仪，检测波长是不可调的，固定为254nm，所以我们都统一采用254m作为青霉素V钾高分子聚合物的检测波长。由于部分青霉素V钾原料和片剂样品中高分子聚合物的含量本来就低，检测波长又不是最大吸收波长，常常导致无法检出的情况。如果将来生产的高分子杂质测定仪能调节检测波长，应该能改善这种情况。 5、小结 -内酰胺类抗生素中的高分子聚合物是产生过敏反应的主要原因，控制内酰胺类抗生素中的高分子聚合物含量，可以保证临床用药的安全有效。国外药典目前尚无有效控制高分子杂质的检测手段。中国药典收载的自身对照外标法定量测定-内酰胺类抗生素中高聚物的检测方法，通过两种流动相的转换，以药品自身对照品取代高分子杂质对照品对-内酰胺类抗生素中的高聚物进行检测，在一定程度上解决了国外无法解决的问题，在国际上属于领先。但由于该方法研究时间不长，与传统的HPLC等成熟的色谱测定方法仍有差距，