SDS-PAGE电泳试剂盒(细胞和组织).doc

SDS-PAGE电泳试剂盒（细胞和组织）(产品编号DBI-1001; DBI-1002)I. 简介:1） SDS-PAGE 电泳实验是绝大部分实验中很重要的一个环节，高纯度的起始试剂是影响凝胶质量的一个重要因素，可靠的电泳结果取决于这一实验的可重复性。该试剂盒中配备了进行SDS-PAGE 凝胶电泳实验所需要的全部试剂，而且对试剂盒进行了优化组合，使实验者可以方便的进行实验。聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以分离从50500kDa 范围的蛋白质分子。II. 试剂盒内容:试剂盒组分DBI-1001 DBI-1002 颜色10 次20 次预混凝胶溶液（30%）分离胶缓冲液浓缩胶缓冲液TEMED试剂AP（过硫酸铵）试剂1*Loading buffer(空白对照)6* Loading buffer（样品使用）蛋白标准（普通）50ml20ml15ml200ul*1支0.06g*4支200ul*1支1ml*1支3支50ml*220ml*215ml*2100ul*2支0.06g*4支200ul*2支1ml*2支6支NMNMNMGRAYGRAYNMNMNM备注：AP（过硫酸铵）试剂在使用前，每只管子中加入600ul的去离子水，溶胶AP试剂，制成10%的溶液，于4度保存备用。10%的AP溶液可保存12周。试剂溶液通常储存在4。C，在混匀或灌胶之前无须恢复到室温。III.蛋白质抽提步骤:一、样品的准备将所抽提好的蛋白质溶液，选用合适的蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。具体内容可参考DBI 公司的Bradford 蛋白定量试剂盒（DBI1045,1046）和BCA 蛋白定量试剂盒（DBI1047,1048）。将抽提好的蛋白质溶液溶解于样品缓冲液中。取500ul的蛋白加入试剂盒中所配备的6* Loading buffer（样品使用）100ul，混匀，于95度10分钟，待样品冷却至室温即可使用。二、分离胶浓度的选择丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的分辨范围15% 1545KD12.5% 1560KD10% 1875KD7.5% 30120KD5% 60212KD实验者可以根据实验的蛋白质分子量大小选用不同的分离胶浓度进行分离胶的配制和实验。T%和C%是通常用来表示凝胶中丙烯酰胺组成的指标。T%是指丙烯酰胺总的含量（w/v）， C%是指交联的丙烯酰胺（即双丙烯酰胺与丙烯酰胺单体的比值（w/v）。有以下公式得出：T%=丙烯酰胺（g）+双丙烯酰胺（g）/总体积（ml）100%C%=双丙烯酰胺（g）/丙烯酰胺（g）+双丙烯酰胺（g）100%三、试剂与缓冲液的准备分离胶的配制（7.5ml）浓度6% 7.5% 8% 9% 10% 12% 13% 15%凝胶溶液（ml） 1.5 1.875 2 2.25 2.5 3 3.25 3.75水（ml） 4.125 3.75 3.625 3.375 3.125 2.625 2.375 1.875分离胶缓冲液（ml） 1.875 1.875 1.875 1.875 1.875 1.875 1.875 1.875AP 试剂（ul） 100 100 100 100 100 100 100 100TEMED 试剂（ul） 10 10 10 10 10 10 10 10取一个10ml 的离心管（也可选用小型烧杯），根据上表选择的分离胶浓度，依次加入凝胶溶液、水、分离胶缓冲液、AP 试剂、TEMED 试剂，迅速混匀。（制成的分离胶溶液须在3 分钟内灌注到玻璃平板内）浓缩胶的配制（5ml，3.9ml）工作液的用量灌制不同厚度的凝胶（两块6cm*8cm）所需的凝胶液量。配制电泳缓冲液取已配制好的5电泳缓冲液150 毫升，加去离子水至750 毫升，备用。5电泳缓冲液配方：总量为1L15.1g Tris 碱（0.125mol/L）72.0g 甘氨酸（0.96mol/L）5.0g SDS(0.5%m/V)准备蛋白质分子量标准品：每个泳道加入5ul 纯化的蛋白质分子量标准便足够。使用的设备1、该试剂盒配备的试剂是根据BIO-RAD 公司的MiniproteanIII 型电泳仪来做配制的；其所配备的试剂和操作步骤也适用于其他公司所需试剂试剂用量凝胶溶液（ml） 0.65水（ml） 3.05浓缩胶缓冲液（ml） 1.25AP 试剂（ul） 100TEMED 试剂（ul） 10凝胶厚度分离胶浓缩胶0.5mm 5.6ml 1.4ml0.75mm 8.4ml 2.1ml1.0mm 11.2ml 2.8ml1.5mm 16.8ml 4.2ml的电泳系统。2、电源（电压200V，电流500MA）三、SDSPAGE凝胶电泳1、按厂商的使用指南用两块干净的玻璃平板和0.75mm 垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上。2、将配制好的分离胶溶液，用加样器将其灌注到玻璃平板夹层中，至顶层约2cm 高为止。3、在用移液器往夹层的液面顶部缓缓加入一层水，让凝胶在室温聚合3060 分钟。聚合后，可见在水层和凝胶层的界面间有一清晰的折光线。4、倾去顶层的水，并以1浓缩胶缓冲液（试剂盒中所配备的浓缩胶缓冲液1 份加3 份水即可）冲洗凝胶的顶层表面。5、用移液器将配制好的浓缩胶加入到玻璃平板夹层，将0.75mm 厚的梳子插入夹层的浓缩胶液体中，必要时补加浓缩胶使液体充盈剩余空间，让浓缩胶室温聚合3045min。6、在微量离心管中，用6SDS 加样缓冲液按5：1（V/V）稀释代测蛋白质样品，于100煮沸35min。同时，按供应商的使用指南融解蛋白质分子质量标准。7、小心拔出梳子，避免撕裂凝胶加样孔。取出梳子后，以1电泳缓冲液冲洗加样孔，并以此缓冲液充满之。8、按厂商指南将凝胶板固定到电泳槽中，同时加入配制好的1电泳缓冲液至刚好淹没凝胶的加样孔。9、用25ul 的注射器将蛋白样品等体积加入到样品孔中，小心加样使样品在孔的底部形成一薄层。10、连接电源，采用恒压电泳法，电压为110V，时间为60 分钟。11、关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液。将凝胶夹层取出。12、将凝胶定位以识别加样顺序，小心将封边的垫片抽出一半，并以此为杠杆撬起上面的玻璃平板，使凝胶保露出来。注意： 检查加样孔中是否有气泡及损坏，损坏的加样孔可以尝试2） 甲醇-CH3OH3) 冰醋酸1. 储存液考马斯亮蓝染液，1L1. 考马斯亮蓝R-250 1.0g2. 甲醇450ml3. 蒸馏水450ml4. 冰醋酸100ml考马斯亮蓝脱色液，1L5. 甲醇100ml6. 冰醋酸100ml7. 蒸馏水800ml2. 染色过程1） 戴上手套避免将手指印留在电泳胶上，将胶移入一个小的盛有少量考马斯亮蓝（20ml 已经足够）的容器内（小心不要将胶撕破）。或将玻璃板连同凝胶浸在染料中轻轻振荡至凝胶脱落；2） 对于0.75mm 的凝胶，可在摇床上缓慢震荡510min，对于1.5mm的凝胶，则需1020min，在染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭容器口；3） 弃去染液，将凝胶在水中漂洗数次。戴手套以避免将双手染色；4） 加入考马斯亮蓝脱色液（约50ml），清晰的条带很快会显现出来，大部分凝胶脱色需要1h，使用过的脱色液则可用水冲洗掉。为了脱色完全，需数次更换脱色液并震荡过夜。注意1. 染色和脱色一般用最短的时间已足够。但如果染色过夜将需要更长的时间脱色，如果脱色后染色显得并不彻底，可以对凝胶重新进行染色。2. 对于低丙烯酰胺浓度较脆的凝胶，可以用一张Whatman3M 的滤纸与凝胶一块揭下来，并将凝胶从滤纸上冲洗至染色容器内。3. 高浓度的SDS 会干扰考马斯亮蓝的染色9。4. 不均匀的染色可能是因为染料没有完全穿透凝胶，也许是加入染料的量不足，或者是振荡的不够充分。5. 菲特异性的考马斯亮蓝染色主要是由于是未溶解的染料的沉淀而成，应将染料溶液过滤后再用。6. 染料易被阳性电荷离子基团所吸引（如Lys、Arg），因此碱性蛋白质染色较深，一些酸性蛋白质则不易检测到21。7. 如果考马斯亮蓝染色的敏感度不够，凝胶可经漂洗后再进行银染色，可以参考银染的具体步骤。8. 染色和脱色可用同一个容器。用清洁剂或有机溶剂，如果甲醇或乙醇沾湿的纸或纱布，既可将容器中的染色擦尽。讨论1） 异常迁移的原因及解决办法31： 蛋白质与SDS 不完全结合引起电泳迁移速率下降；在下述条件下会出现这种情况：没有被完全还原的蛋白质；化学性交联的蛋白质；糖蛋白、酸性蛋白、马来酰化蛋白质或琥珀酰化蛋白质。 蛋白质固有的净电荷数决定着其与SDS 联结合所带来的电荷总数。例如组蛋白，在电泳中会有相对异常的迁移率。 分子量在15kDa 以下的蛋白质在SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳中比较反常，主要是因为它们的荷质比与大的蛋白质不同，而且小粒子在凝胶中迁移时其特性会发生改变，SDS 尿素胶可以部分的解决这些问题。SDS 尿素PAGE 分离蛋白质范围是100010000kDa。 如果在应出现单一蛋白质条带的情况下而出现了双带，可能是部分蛋白质样品没有被完全还原，增加样品缓冲液中-巯基乙醇的浓度可解决这一问题。但也可能是蛋白质水解引起的。 很多疏水的蛋白质（如：大肠杆菌乳糖通透酶）可以联结过量的SDS，并显示很高的电泳迁移率。提高丙烯酰胺浓度可以得到更精确的分子量。因此在有去垢剂的情况下进行电泳可以提供最满意的分辨率。然而和凝胶微粒大小相同的去垢剂，如Triton X-100，穿透聚丙烯酰胺凝胶能力较差。另外，如果用非离子型去垢剂，蛋白质迁移距离短于_同样荷质比的蛋白质，并且其迁移率与分子量没有直接比例关系。2） 样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS 的沉淀，应该在加入样品缓冲液之前将其除去。3) 一些蛋白质需要快速固定，否则他们会扩散出凝胶。4） 过硫酸胺会干扰酶的活性，预电泳或用核黄素有助于排除这一干扰。5） SDS 经常会抑制酶的活性，有多种方法可用来从SDS 聚丙稀酰胺凝胶中恢复酶的活性。对于SDS-PAGE 后酶的处理，可以参考文献。