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基因工程与油菜育种李彦龙（河西学院农业与生物技术学院 甘肃张掖 734000）摘要：转基因油菜的农艺性状明显优于普通油菜，表现在抗病虫性、抗逆性等优良特性上。反式烯脂酰-CoA 还原酶(trans-2，3-enoyl-CoA reductase， ECR)是催化超长链脂肪酸(VLCFAs)合成的脂肪酰-CoA 延长酶之一。根据已报道拟南芥ECR 基因设计引物， 采用RACE (rapid amplification of cDNA ends)方法从甘蓝型油菜中克隆ECR 的全长cDNA 序列和对应的基因组序列， 命名BnECR 。根据编码区预测BnECR 前体蛋白为一个310 个氨基酸残基的多肽链， 包含ECR 蛋白的重要功能位点K144、R145 及一NAD(P)H 结合基序G225SGGYQIPR/HG234。BnECR 在高芥酸材料种子发育中后期的表达量显著高于低芥酸种子， 表明BnECR 可能参与甘蓝型油菜芥酸的合成。BnECR 克隆到酿酒酵母的穿梭表达载体中， 分别转化野生型酵母By4743 和突变体菌株YDL015c，添加半乳糖诱导表达。关键词：油菜，选育，克隆，芥酸1转基因油菜后代的农艺性状表现及其抗虫性研究 油菜作为重要的食用油来源及工业原料，其发展和生产一直受到人们的重视，2006年，我国油菜种植面积已达到666.7万hm2。但是由于国内油菜籽产量与食用油消耗量差口较大，1999/2000年度我国油菜籽进口量一度创下385.5万t的历史最高纪录，2003/2004年度油菜籽进口量也维持在41.8万t左右。因此，扩大油菜种植面积，提高油菜单产已成为我国油菜生产的当务之急。目前，影响油菜生产的因素除通过政策调整提高农民种植油菜的积极性外，病虫害对油菜生产发展的制约也不容忽视。特别是虫害，常年的虫害发生面积都很大，全球每年因虫害对农业生产所造成的损失仍高达20%30%1。在我国油菜菜粉蝶Artogeia(pieris)rapae(Linnaeus)的发生面积就占油菜播种面积的20%以上。 利用植物基因工程培育抗逆性油菜品种，已被证实是行之有效的油菜育种手段6。几丁质酶(chitinase)广泛存在于昆虫、微生物和植物体内，它能够降解外侵生物的完整结构(如膜或昆虫表皮、卵壳或线虫的外壳)， 或释放出能诱导寄主产生其它防御反应的物质，从而对某些昆虫(尤其是同翅目昆虫)表现出一定抗性。蝎毒是一种富含生物活性的多肽物质，蝎毒中有一类神经毒素专一作用于昆虫而对哺乳动物无害或毒性很小，因此可利用此类昆虫特异性的蝎神经毒素(insect-selective scorpion neuro toxin)来研制新型生物杀虫剂和抗虫害转基因植物。采用农杆菌介导法将双价质粒pBI101-chi-Bmk质粒导入油菜，获得了转基因植株的种子2，3及其后代，旨在通过对其进行分子检测、农艺性状筛选以及抗虫性鉴定等手段，选育到抗油菜菜粉蝶虫且其它农艺性状优良的转基因油菜纯合株系。1.1 种子卡那霉素筛选结果目的基因是以单拷贝、单位点整合到转基因植株的基因组个。符合孟德尔单显性基因的遗传分离比例3:1。1.2 PCR检测结果 一方面证明了目的基因在转因植株中能够稳定遗传，另一方面说明PCR检测结果可作为转基因纯合系选育指标之一。此外，在对T3代的PCR检测中，发现有个别样品检测结果为阴性，可能与基因在世代交替过程中的丢失关。1.3农艺性状调查结果 各代转基因植株或株系的农艺性状调查值与其对照间无明显差异，所存在的微小差异不大于品种内或株系内各株间的差异。从而证明转基因手段对油菜育种没有不良影响。1.4抗虫鉴定结果转基因植株的抗虫性明显高于对照植株，证明转几丁质酶基因和蝎毒蛋白基因可提高油菜植株的抗虫性，通过植物基因工程技术培育抗虫油菜新品种是一种快速而可行的方法。2 甘蓝型油菜烯脂酰-CoA 还原酶基因BnECR 的克隆及功能分析4超长链脂肪酸(very long chain fatty acid，VLCFAs)是指碳链长度为20 碳或更长的脂肪酸。常见的有花生酸(C20:0)及其饱和同系物、芥酸(C22:1)及其衍生物山嵛酸、蜡质(前体)等。这类脂肪酸参与生物膜膜脂、鞘脂、木栓质及角质层蜡质的合成，在植物体中具有广泛的生理功能。植物VLCFA的合成是在内质网上脂肪酰-CoA 延长酶的作用下进行的。脂肪酰-CoA 延长酶属于膜结合的多酶复合体， 包括-酮脂酰-CoA 合酶(3-ketoacyl-CoA synthase，KCS)、-酮脂酰-CoA 还原酶(3-ketoacyl-CoA reductase， KCR)、-羟脂酰-CoA 脱水酶(3-hydroxacyl-CoA dehydratase， HCD)和反式烯脂酰-CoA 还原酶(trans-2，3-enoyl-CoA reductase， ECR)， 分别催化缩合、还原、脱水和再还原4 步反应。拟南芥延长酶中这4个酶基因已被陆续分离。催化最后一步延长反应的ECR被认为是所有微粒体脂肪酸延长酶所共有的， 没有底物特异性。Kohlwein 等从一个温度敏感、缺乏鞘脂合成的酵母突变体tsc13中分离了编码ECR 的基因TSC13， 并指出TSC13 蛋白主要分布于内质网核泡分界处。拟南芥AtECR 功能互补于酵母突变体tsc13， 编码的ECR蛋白为脂肪酸延长酶活性所必需， 在拟南芥植株中普遍表达;其T-DNA 插入突变体导致鞘脂、角质层蜡与种子VLCFA 合成受阻， 抑制细胞扩增， 植株变形。烟草NbECR 基因沉默导致烟草膜结构紊乱、皮层细胞消融。棉纤维发育中GhECR 基因参与了VLCFA的合成。芥酸是十字花科植物种子中特异积累的长链脂肪酸， 改良芥酸的含量是油菜品质育种的重要目标之一， 菜油中芥酸含量的水平直接影响菜籽油的食用营养价值和工业应用价值。因此， 对以芥酸为代表的长链脂肪酸的研究具有重要的理论和现实意义。对油菜脂肪酰-CoA 延长酶的研究， 主要集中于KCS 的研究。油菜中编码KCS 的同工酶基因Bn-FAE1.1 和Bn-FAE1.2 特异性催化发育种子中芥酸等的合成。但Bn-FAE1.1 起主要作用， 并主要存在于高芥酸品种油菜中。编码KCR 的基因Bn-KCR1 和Bn-KCR2 近期也从高芥酸品种油菜中被分离， 二者在高芥酸与低芥酸品种的发育种子中表达差异显著。甘蓝型油菜中编码HCD 和ECR 的基因还未见报道。本研究从甘蓝型油菜中分离克隆了编码反式烯脂酰-CoA 还原酶的BnECR 基因， 并对该基因的功能进行分析， 研究结果有助于进一步理解油VLCFA 合成、代谢机制， 为充分利用改造脂肪酰-CoA 延长酶基因来调控油菜VLCFA 合成奠定基础。2.1 BnECR 基因的克隆与核苷酸序列分析 利用引物组合FECR3-1/3-P、FECR3-2/3-NP和FECR5-1/5-P、FECR5-2/5-NP 分别进行3cDNA和5cDNA 末端的一扩与巢扩， 获得与预期大小相符的电泳条带。测序结果与GenBank 中的序列进行同源比对表明， 获得的cDNA3末端序列和5末端序列与拟南芥ECR 基因AtECR (NM_115394)同源性最高。根据测序结果设计了一对扩增全长cDNA 的引物FECR/RECR， 从甘蓝型油菜总cDNA 和gDNA 中扩增得到了预期大小的片段。该基因的cDNA 序列全长为1 328 bp (不包括polyA尾)， 对应的基因组序列长度为2 093 bp， 被命名为BnECR (GenBank 登录号分别为FJ899705 和FJ899706)。如图1 所示， 933 bp长的ORF 被3 个内含子隔开， 与已报道的拟南芥AtECR 结构相同。在ORF 上游有一个163 bp 的5UTR， 在ORF 下游有一个232 bp 的3UTR， 随后是polyA 尾。NCBI Blastn 同源分析表明， BnECRcDNA 序列与AtECR 同源性最高， 为86%; 其次是与棉花GhECR2 (EU001743)， 同源性为77%， 与GhECR1 (EU001742)、烟草NbECR (DQ000300)的同源性为74%。ORF 水平上BnECR 与AtECR 的同源性达到89%， 即使与酵母ECR 基因ScTSC1 3(NC_001136)也有46.5%的同源性。从核苷酸水平的同源性分析来看， BnECR 是拟南芥AtECR 的垂直对应基因。2.2 预测BnECR 蛋白的分析 在Vector NTI Suite 8.0 上对BnECR 的ORF 进行了翻译， 根据核苷酸预测的BnECR 前体蛋白由310 氨基酸组成， 分子量为35.78 kD， 等电点为9.52。通过NCBI Blasp 对BnECR 蛋白进行分析表明， 它与拟南芥AtECR(NP_191096)最同源， 一致性/相似性为97.1%/98.7%、其次是与棉花GhECR2(ABV60089)为85.0%/92.0%， 与GhECR1(ABV60088)为82.6%/90.3%， 与烟草NbECR(AAY17262)为82.6%/90.6%。在Vector NTI Suite 8.0 上进行多重序列比对及系统学分析表明， BnECR 和AtECR 最相似， 聚在一个亚组里。虽然BnECR 与GhECR、NbECR 也有很高的同源性， 但在许多氨基酸残基位点上BnECR 更趋向于与AtECR 同源。2.3 BnECR 的表达分析 AtECR 参与拟南芥所有VLCFAs 的合成。为了解BnECR 的表达模式， 本研究采用甘蓝型油菜5B 的根、茎、叶、花、角果的RNA 样品进行半定量RT-PCR 分析。结果表明， BnECR 在所检测的组织中普遍表达， 但同时也存在组织器官特异性。BnECR 在茎中的表达量最高， 在叶、花中中等表达，在根和角果中的表达量最低。同时也研究了BnECR 在油菜高芥酸材料83501R 和低芥酸材料2821R 种子不同发育阶段的表达。总体来讲， BnECR在高芥酸材料中的表达丰度高于低芥酸材料。种子发育初期， BnECR 在高芥酸材料中的表达略高于低芥酸材料， 在花后40 d 的种子中高芥酸材料表达量达到最高。低芥酸材料种子中的表达随发育进程逐渐减弱。这表明BnECR 参与了甘蓝型油菜芥酸的合成。2.4 BnECR 基因在酿酒酵母中的功能分析 利用带有酶切位点的引物FECRO/RECRO 以甘蓝型油菜cDNA 为模板进行PCR 扩增， 经亚克隆、测序验证后的阳性克隆， 抽提质粒。对质粒和表达载体pYES2.0 分别进行Sac I 和Xba I 双酶切， 回收目的条带和载体骨架， 连接后转化大肠杆菌DH5，从含有Amp 的LB 平板上挑选转化子， 培养阳性克隆子， 抽提质粒。经过PCR 和酶切鉴定正确， 得到构建成功的重组质粒pYBnECR。将空载体pYES2.0和重组质粒pYBnECR 转化到酿酒酵母野生型BY4743 和突变体YDL015c 中， 在SC-Ura 平板上筛选到对照菌株和转化菌株YBnECR， 以转化空载体的受体菌为对照， 诱导表达外源基因。经过GC分析，如图6 所示， 对照菌株和工程菌株都显示了典型的酵母脂肪酸组成， 并以C16 和C18 的饱和、不饱和脂肪酸为主。在本试验条件下， 长于18 个碳的脂肪酸只检测到芥酸(C22:1)。对BY4743 的转化结果表明， 转化菌株中的芥酸(C22:1)占总脂肪酸含量的1.34%， 是对照的1.52 倍， 差异显著(P0.05)。说明BnECR 蛋白促进了芥酸的合成。YDL015c 的转化结果表明， 转化菌株中的芥酸(C22:1)占总脂肪酸含量的0.96%， 是对照的4.17 倍， 与对照差异显著(P0.05)。表明突变体恢复了芥酸的合成能力。酵母超表达和酵母突变体的功能互补分析分别证明BnECR 蛋白能够介导芥酸的合成。3 结果分析3.1 转基因与农艺性状 外源基因导入会对受体植物内源基因的表达调控产生一系列影响，导致表型变异，如株高降低、推迟开花、产量性状和育性明显降低、单株有效穗数增加等。转基因植物的性状变异可能是由于无性变异和外源基因导入共同引起的5。外源基因的表达打破受体内原有的能量供给和消耗平衡，造成一些性状表达所需能量的相对不足，影响生理代谢，并促进表型的变化，导致转基因杂交后代农艺性状的变化。而在组织培养过程中，细胞可以发生染色体数目变异，结构变异(包括染色体的断裂、易位、倒位、缺失、重组等)，核基因的扩增、丢失、突变重组等变化，进而造成转基因植物农艺性状上的变异。根据本研究结果，转基因油菜农艺性状与对照比较变化不大，这与官春等的结果一致。可见通过转基因方法与传统育种方法密切结合来改良现有油菜品种性状，选育出非目标农艺性状、经济性状基本保持不变，从而最终产量基本保持不变，甚至更优的油菜新品种是完全可能的。进而在确保转基因油菜产量的基础上，增加了油菜的抗虫性，还可减少由于虫害发生而大量的人力、物力投入，有助于环境保护。3.2转基因与油菜育种 自1986年V.H.Mathew等首先将NPT-基因利用农杆菌介导法转入芥菜型油菜以来，转基因油菜研究有了长足的发展，2005年，转基因油菜种植面积已达到360万hm2。我国于1995年开始进行Bt毒蛋白基因6、TA29核酸酶基因7、反义FAD2基因8转化甘蓝型油菜的研究;浙江省农科院陈锦清博士等进行了利用反义PEP转化甘蓝型油菜提高种子含油量的研究。2000年，我国首个转基因抗虫油菜诞生。采用农杆菌介导法将几丁质酶基因和蝎毒蛋白基因同时导入油菜，获得了抗虫油菜株系。总之，植物基因工程技术应用于油菜育种，在提高油菜品种的抗逆性、改良品质等方面取得了很大成功，加之转基因油菜种植面积的不断扩大，均显示了转基因技术在油菜育种领域应用的巨大潜力。4 讨论 在PCR反应体系中，dNTP、引物、Mg2+和Taq酶是4个主要的影响因子，它们之间的相互作用会影响扩增结果。对于不同物种或在不同试验条件下，需要对这些因子的最佳组合浓度进行优化。在本试验当中，不同处理间确实存在明显差异。dNTP、primer和Mg2+分别在150mol/L、1.5mol/L和1.0mmol/L时，扩增效果最差，说明小桐ISSR-PCR扩增体系中，当dNTP、Mg2+和primer的