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一种基于磁致电阻工艺的生物传感器摘要： 我们正在研究一种生物传感器，这种装置可以用来测量分子尺度上的联结DNA、抗原体与及配合体的力。分子阵列计算器（BARC）就是通过这种力维持磁球在一个固态培养基上。在磁力的作用下，培养基上的磁阻可以指示分子的的动向。配合磁电计算器存储技术，在一个芯片上制作数以百万计的交换器来测量几千个分析物也成为可能。这种轻便的传感器的大容量性是理想的定点探测仪器，而其潜在的分子力测量的直接性将对药品的研发有指导作用。1. 绪言通过原子显微镜分析测量力过去的十年中，出现了大量的直接测量联结DNA、抗原体与及配合体的力的方法以帮助识别分子。这些方法都涉及到分子约束力和双表面接触分子的接触和分离。诸如表面张力设备与及放射性线性分子标记实验的方法给我们提供了大量有用的数据，然而这些数据更多的是在一些比较宏观的层面上。在更微观的尺度上，如最终了解明确的分子的结合和分离的细节，使用的方法是micropipet-mounted membrane capsules和原子力显微镜，这些方法能够测量到独立分子之间的作用力。原子力显微镜能被用来测量两个DNA分子之间的作用力。在这一类实验中，一个隔离的血细胞DNA分子被附于悬臂式测力传感器的尖端，并且固定于一个稳定的底层。引入160个基本长度单位的血细胞分子。当靠近尖端和衬底时，其中血细胞分子就有可能靠近另一个在衬底或者是尖端上的血细胞分子，因此便撑起了这两个表面。而尖端和衬底也因此而分离了。在Fig1的例子里，悬臂在DNA分子松弛之前由于受到DNA的拉力不会测量到任何力。当DNA的拉力达到600PN的时候，DNADNA键就会断开，而悬臂上的拉力也就解除了。这种断裂的负极点的现象表明只有一个血细胞分子连接尖端和样本。由于血细胞分子不存在的时候没有观察到支持力，在某种意义上原子力显微镜探测到了独立分子的存在。原子力显微镜也可以用于测量其他分子之间的作用力，目前大家比较关注的是抗体和抗原体对。然而，这类测量是仍处于实验阶段的基本研究。我们的目的是检测在一些基础应用上分子相互作用的特性，如药检屏幕和定点检测。为了实现这个目的，我们研究了一种测量分析力的方法在分子量级上的磁性微生物检测法。这种方法受启于原子力显微镜法但更加符合我们的应用需要。虽然AFM适合做理想的基础研究，但并不是实际应用中经济的生物传感器。这是由于AFM的化学性敏感部分是由极少的安置在一个锋利尖端上的分子组成的。被分析的分子必须单独定位和探测，所以每次分析一个AFM至少需要15分钟才能获得一些有意义的观测数据。在这一段时间里由于尖端和衬底的多次接触导致尖端受污染或是分子活性降低，因此尖端必须经常清洗或者直接更新。虽然在基础性试验研究中这种尖端污染不算是什么大问题，但是在数百次测量平时的普通样本时这个问题便尤为突出。此外，AFM是一种要求极低的外界干扰（颤动）的装置，而且要求使用者受过专业训练并且在使用的时候要求使用者持续不断的监控。在许多通常的AFM实验中，Hoh et al曾经使用磁场力显微镜（MFM）来间接地控制生物分子的结合。链锁状球菌和维生素H的结合体可以在磁头和衬底之间形成。一个磁性的AFM尖端这时就可以重复地检查尖端和衬底之间越来越小地距离，因而施加在磁头上的力也越来越大。悬臂的偏转角度准确的记录下了MFM图像的改变，从而可以得到由力的大小变化。最终这种结合体发生断裂，磁头一下子弹到MFM的尖端然后消失在MFM的图像视野里。这种磁性跳跃消除了传统的AFM实验中尖端运动方向不垂直于水平面或者不平行于配合感应器的轴线所带来的弊端。然而，和AFM一样，这种方法每次也是只能观测一个分子。2. 珠状阵列计算机的概念2.1. 磁球实验我们正在发展一种使用磁性微生物来探测和标记许多单个分子之间的相互作用的方法。我们所用的方法源于Fig.1中所提到的方法，也有从磁性跳跃方法中所得到的灵感。不同于搭接AFM的尖端和衬底，这种方法用目标DNA分子将衬底和磁球连接起来。将溶有数千磁球的水溶液涂于衬底上，使衬底上附有磁球。然后使用外界的磁场力和衬底发生作用，这样便可根据磁力的大小来测量衬底磁球的数量。这类实验的一个重要特征是磁力和衬底垂直，如果平行于衬底，衬底的磁球上就会产生于一个支点，而分子键之间的作用力就会通过这个支点以类似杠杆作用的形式得到放大。由于这样的衬底表面制作出来不是特别的光滑，因此这种杠杆作用力放大的倍数也不是那么容易控制。使用受控的磁力我们可以移动衬底上的磁球。例如我们可以将特殊分子和一般分子区分开来。如果将非特殊化处理的衬底所受的污染减到最低，使用1pN的力持续510秒钟便可以将99 1%的非特殊分子从缺乏DNA抗体探测器的衬底上提取出来。这种程度上的力不会破坏分子键。磁球实验可以认为是一种使用磁力的实验而不是放射性标记实验。其他的实验早就被人定义为使用磁性标签的简单敏感生物传感器技术。在我们的实验中我们也曾经试图使用AFM技术来探测单个的目标分子，但这样的话就不能同时测量几千个分子了。因此这个实验将所有的东西溶进一个生物传感器里来测量分子间的作用力。这种生物传感器的使用方法很大程度上取决于测量方法。使用光学显微镜是测量衬底磁球的最简单的方法。这种方法在实验室里通常是用来开发新的方法用的。在将来这种方法可能会用于生物分子识别中的基础研究。或者，可以通过磁力转换器来测量总的磁力从而推算出有多少磁球。我们的研究主要着力于开发对病毒、细菌和毒素的定点测量方法。本文讲述的正是一种支持大规模分子探测的磁电探测器。2.2. BARC的原理近年来磁性材料研究方面的发展使我们可以制作出能准确捕捉到微米量级的磁场敏感物的存在。这种磁性材料的典型代表就是金属多层膜，其特性就是材料的电阻率随着外加磁场的改变而改变。最基本的几种磁阻材料包括各项异性铁磁材料（AMR）和巨磁电阻材料（GMR）。磁阻传感器在商业上用于读出磁带和磁盘、便携式磁场感应器和定位感应器。我们还可以使用磁阻材料来制作磁球探测装置。这样的装置可以安置于实验中的衬底以方便即时探测出周围的磁球。而这种措施在光学上或者是化学微量物质的探测中最主要的优点就是数以千计的探测器可以置于一块1x1cm的芯片上进行探测。这种技术有望在三年内用于商业生产电脑内存。 因此我们可以想象一下磁阻探测生物传感器排列成数以千计的阵列BARC。然而制作这样大规模的抗体绝非易事。阵列包含了数以千计的DNA探测器，在商用上已经可以合成了。因此我们对BARC的发展方向更多的事趋向于DNA培植而不是免疫测定。更详细地说，我们的项目聚焦于使用PRC来测量血液样本中病原体的多样性。 尽管如此我们仍然希望能研制出未来能用于免疫测定的BARC，而BARC最大的功能实际上是用来测定分子结合力。因为分离每20bp的DNA键需要1。52nN的力，目前的DNA结合力测量装置显然是不适合的。在BARC培植实验中，磁力也就是用来区分正常分子与非正常分子。 一个BARC实验运行如下：微磁阻单元被安置在一个探测器芯片上。这样的单元表面覆盖一层氮化硅以抗腐蚀。使用一层二氧化硅来固定住DNA探头于玻璃或者是硅晶表面。为了顺序探测每一个DNA，将一个低聚物探头固定于探测器芯片上一个唯一固定的地方。使用者将维生素光电导继电器注入到BARC器皿上，然后让其自由流动到放着芯片的容器单元。PCR的产品和补充探头相互杂交配置。将成对的磁性微生物和维生素H的结合体放在分析物上，这样就做成了芯片上的固定的一部分。 这种杂交作用的结果就是使得磁性粒子通过DNA之间的相互作用粘附到磁阻敏感单元。通过磁力来探测磁性分子的粘附力的大小，探测器芯片就可以计算出磁性分子的数量。这种统计结果可以说明分析样本中DNA分子的浓度。附着在敏感单元之间的磁性分子对实验没有任何影响也就不会被计算到，因此这些单元之间的部分就形成了浪费。我们的最终目标就是制造出高密度的极少或者是没有赘余空间的传感器阵列。 让很多分析物分子都能各自连接到一个传感器也是可以实现的。但是这种方法只有在使得传感器达到饱和时候才会有明显的意义，这样的话必须将样本稀释以降低分析物的浓度。2.3. 磁性粒子一些公司使用磁性微小粒子来进行生物化学方面的分离工作，这种手段也同样适用于我们目前所致力的研究。这些磁性粒子的主要成分是铁的氧化物，通常是磁赤铁矿(g-Fe2O3)。典型的方法是使用纳米量级的铁的氧化物颗粒，然后在在这些均匀铺开的颗粒上覆盖一层单晶硅这样就形成了直径1um的磁珠。纳米级的铁的氧化物颗粒只有在外磁场的作用下才会表现出磁性；当外磁场撤去的时候磁性也立即消失，因此这些磁珠不会相互吸引而聚集成团。 因为其稳定性，铁的氧化物是天生的良磁性材料。但由于它是亚铁磁材料而导致其磁性不是很强。此外，商用的磁珠通常含有1060%的铁的氧化物成分。结果就是几乎不可能使每个磁珠产生10PN以上的力。将抗体抗原体结合体分离开来需要100pN的磁力，这就要求一种能产生高磁力的材料。但是在迄今为止这种磁珠总是自动凝聚成块或者在磁场的作用下聚集。另外一种方法是使用微米量级的磁体，就如Hoh etal. (1994)使用过的一样。小磁体能够产生巨大的磁场梯度但只能覆盖很小的范围，因此必须检测整个样本。我们关注的是简单的将特殊磁珠从非特殊磁珠中分离开来，这种力需达到1pN以上。 本文所描绘的是使用Dynabeads M-280这种仪器来进行实验的一种方法，这种仪器使用的磁珠是从赤铁矿上得到的直径2.8um的颗粒。将Dynabeads聚集在一起以得到一个高度统一的直径。然而Dynabeads M-280中的物质不是都具有磁性的，而且这种材料的的磁感应强度要低于其它的商用磁珠，只有8.0 kA/m。计算表明这些磁珠聚集以后能达到的最大磁场也就是0.3 mT。2.4. 磁阻探测的方法为了证明能用磁阻来探测磁性微粒的存在我们设计了几个GMR传感器的阵列。这种阵阵列是使用固定电荷来制作的，主要成分是0.1 um厚的三明治结构的GMR磁阻条。当外加磁场增减4 kA/m时GMR材料的电阻值降低4。使用0.1 um厚的的铝线来连接传感器。整个芯片被涂上一层0.1 um厚的的氮化硅保护层，使得芯片也可以在含盐的环境中使用。如果将磁电阻传感器放在XY平面上并且在X方向通上电流，那传感器就只能感应到X方向的磁场。因此，为了探测芯片上具有超顺磁性的磁球，我们加一个Z方向的外加磁场，这样磁球将产生一个包含X方向的相应磁场。Dyna磁球M280可以探测到小于等于0.3mT的感应磁场而不会被10mT的外加磁场所淹没。然而，外加磁场不可能是均匀的（因此磁场也就不会严格地垂至于传感器平面），传感器也因此随着在磁场中位置的不同出现0.11 mT的磁场偏移。这一偏移量是在没有磁球而且减去了后来的测量结果而得到的。为了得到一个最佳的信噪比，我们在使用一个主传感器的同时还使用了一个参考传感器。（看图8. 这两个传感器由慧思通桥连接到一起，这里并不使用GMR测试方法因为这样可能会超出量程。）所使用的的偏置电流是2.5mA的直流电流。磁场是由一个标准通用的磁体来提供的，磁体参数调制在200Hz，4 kA/m RMS以锁定在测量状态。如图9所示，当一个Dyna磁球放置于许多GMR传感器中时就会产生信噪比。很显然当减少传感器的表面积的时候感应的灵敏度也随之降低。讨论如下，化学的灵敏度随着DNA杂交区域面积的增加而增加。因为磁球只有只能在束缚在一个传感器的顶端的时候才可以被探测到，所谓的活跃区域面积就是指传感器参与一个特定的分析物的探测的所有表面积的总和。因此，BARC矩阵最好能包括大量的小传感器。2.5. BARC分析多个样本的可能最终一个BARC芯片所能容纳的分析物的数量取决于活跃区域面积的总和与及每个分析物所需的面积。由于每个传感器单元之间需要一定的距离来连接到offchip偏置电流源上，总的活跃区域面积就受到了限制。为了解决单一offchip带来的局限性，达到芯片表面积的完全利用，可以采取onchip转换电流的方法来给上千或几百万个多元单元提供偏置。包含256K或者更多单元的矩阵早就在MRAM上的到了应用，这一方法原理上也适用于BARC，而且BARC传感器的一些设计标准，如读入时间。灵敏度和密度等方面的要求要远远低于MRAM的要求。如果使用这样的一个阵列，每一种类型的探测器将会由几千个固定在一定区域的传感器组成，该区域的最小面积取决于传输线和磁球的的限制。如果活跃区域的探针很小，那么传输线的面积大小将影响到实验的精确度。与活跃区域接触的分析物分子的数目N可用下式来表示： N = kAt(C - C0)其中k时传输系数( 0.001 m/s)，A时活跃区域面积，t是杂交时间，C是分析物分子在用于传感器芯片上的溶液中的浓度（单位是每立方米），C0是传感器表面的浓度，最初为0。假定至少探测到一种物质的10个以上的分子才能证明它的存在，即N1000能产生10个结合体，A25 600 um2（相当于64个传感器，每个有805um），t600s，那么最小探测分析物的浓度就是1.010-16 M,或者65 000个分子/毫升。因此，就算是活跃区域的探针也明显比这个例子中计算的结果小得多，传输线的限制不会影响BARC的灵敏度等同或者超过其它10-12 M的生物传感器的灵敏度。 活跃面积是我们