植物抗旱生理指标测定原理及方法.doc

植物抗旱生理指标测定原理及方法 生命科学学院 杨歌指标测定：一、 可溶性糖（蒽酮法）二、 脯氨酸三、 丙二醛四、 叶绿素五、 蛋白（考马斯亮蓝法）六、 超氧化物歧化酶（SOD）七、 过氧化物酶（POD）八、 谷胱甘肽（GSH）九、 电导率一、 可溶性糖含量的测定1.蒽酮法1.1原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在可见光吸收峰位620nm。测定对象：几乎可以测定所有的碳水化合物，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应，所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量）。1.2 步骤试剂：(1)浓硫酸； (2)蒽酮乙酸乙酯试剂：蒽酮-1g 加乙酸乙酯至-50ml实验步骤：（1） 称取样品0.1g，置于研钵中，加4ml ddH2O研磨成匀浆，8ml ddH2O洗涤研钵。（2） 100C沸水浴10min，冰上冷却。（3） 4000rpm离心10min。（4） 取上清5ml转移至100ml容量瓶定容。（5） 1ml提取液+ 1ml ddH2O+0.5ml蒽酮+5ml浓硫酸，轻轻混合均匀，100C沸水浴10min，冰上冷却。（6） 620nm处测吸光值。1.3 计算方法可溶性糖含量%=C*V/(W*106)*100% V为植物样品稀释后的体积（ml）-100mlC为提取液的含糖量（g/ml）-根据标准曲线计算W为植物组织鲜重量（g）-0.1g问题及质疑：1.目标糖含量：标准曲线是用葡萄糖位标准制作的，而蒽酮法是测总糖的量，包括己糖、戊糖，浓硫酸将淀粉、纤维素水解成的单糖，将总糖得出的OD值代入由单一糖做出的标准曲线，有一定误差存在。注：查看所有文献的标准曲线都是用葡萄糖制作。2.误差分析：（1）不同糖类与蒽酮试剂反应的显色程度不同。果糖最深，葡萄糖次之， 半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖最浅造成误差。（2）蒽酮试剂溶解度较低，非常容易析出，在反应时加入糖的水溶液中，出现浑浊现象，影响反应进行。（3）介于以上原因，将上清5ml转移至100ml容量瓶定容，稀释程度过大，当糖含量少的时候，大的误差可能会掩盖真实的糖含量。造成品数据没有实际意义。方案修改意见：1. 首先，做五到六组空白，测试分光光度计误差程度。2. 增加平行组数，由三组增加至五组，减少每个样品测试次数。3. 改变测试样品定容量，由100ml变为50ml。二、 脯氨酸含量的测定1. 茚三酮法1.1原理在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10-100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。1.2步骤 试剂：（1）25%茚三酮：茚三酮-0.625g 冰乙酸-15ml 6mol/L磷酸-10ml 70C水浴助溶； （2）6mol/L磷酸：85%磷酸稀释至原体积的2.3倍； （3）3%磺基水杨酸：磺基水杨酸-3g 加蒸馏水至-100ml实验步骤： （1）称取0.1g样品放入研钵，加5ml 3%磺基水杨酸研磨成匀浆，100C沸水浴15min；（2）冰上冷却，4000rpm离心10min； （3）提取液2ml+冰醋酸2ml+25%茚三酮2ml混合均匀，100C沸水浴30min，冰上冷却； （4）加4ml甲苯混合均匀，震荡30s，静置30min； （5）以甲苯为空白对照，再520nm下测定吸光值。1.3 计算方法脯氨酸含量（g/gFW） X * 提取液总量（ml）/样品鲜重（g）*测定时提取液用量（ml）*106公式中：X-从标准曲线中查得的脯氨酸含量（g） 提取液总量-5ml 测定时提取液用量-2ml问题及质疑：1.酸性体系下，脯氨酸与茚三酮加热反应后的最终产物为红色，再实验过程中，仅有少数时候能发现红色产物。原因有待确定。2.经查看文献资料，反应步骤已经是优化的，没有问题。甲苯萃取脯氨酸与茚三酮的反应产物，消除了多余未反应的茚三酮，磺基水杨酸，提取液中其他杂质（如色素）以及PH变化的干扰。3.根据茚三酮与脯氨酸的缩合反应分析：（1）反应体系的PH控制很重要，保持酸性环境，否则，反应产物的最大吸光值并不在520nm。（2）极限干旱材料或者重脱水材料的脯氨酸含量大，材料干重比新鲜材料多数倍，加相同量的茚三酮，反应程度应该有所不同。而脯氨酸含量少的样本，容易受到各种因素的干扰。三、 丙二醛含量的测定1. 原理植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（MDA）是膜脂过氧化最重要的产物之一，因此可通过测定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。 丙二醛在 高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA）反应产生 红棕色的产物3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮（三甲川），该物质在 532 nm处有一吸收高峰，并且在 660nm处有较小光吸收。由于醛、可溶性糖对此反应有干扰，在 450 nm处有一吸收峰，用双组分分光光度法加以排除。2. 步骤试剂：（1）10%三氯乙酸（TCA）：TCA-25g 加ddH2O至-250ml （2）0.6%硫代巴比妥（TBA）：TBA-0.6g 加5%TCA至-100ml实验步骤： （1）称取材料0.1g，加10% TCA 2ml研磨至匀浆，再加8ml进一步研磨； （2）4000rpm离心10min，取上清至新管； （3）2ml提取液+2ml 0.6% TBA，混合均匀，2ml ddH2O+2ml 0.6% TBA为空白对照； （4）混合沸水浴15min，冰上冷却； （5）4000rpm离心10min； （6）取上清再532nm，600nm，450nm波长下的光密度值。3. 计算方法 式中，Vt：提取液总体积（mL）-10ml； Vs：测定用提取液体积（ml）-2ml； FW：样品鲜重（g）-0.1g。注意事项：1可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于极度干旱时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。2低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为0.5 nmol L-1）3如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。四、 叶绿素含量的测定1. 乙醇法1.1 原理 叶绿素广泛存在于绿色植物组织中，当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热较敏感；高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。叶绿素的含量测定方法有分光光度法，利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯比尔定律计算出提取液中各色素的含量。叶绿素a 和叶绿素b 在645nm 和663nm 处有最大吸收，且两吸收曲线相交于652nm 处。因此测定提取液在645nm、663nm、652nm 波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。1.2 步骤试剂：95%乙醇实验步骤：（1）称取样品0.1g放入研钵，加3ml 95%乙醇研磨至匀浆，再加7ml 95%乙醇研磨至组织变白，避光；（2）4000rpm离心10min；（3）取上清5ml定容至25ml；（4）95%乙醇为空白对照，在645nm、663nm、652nm波长下测定光密度值。1.3 计算方法 D663=82.04Ca +9.27Cb D645=16.75Ca +45.6Cb (浓度单位：g/mL） C