ELISA法检测抗体效价.doc

ELISA间接法检测抗体效价实验原理：ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），酶联免疫吸附实验。指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。ELISA操作过程：（一） 抗原包被（蛋白包被浓度一般是0.5 ug-10 ug） 准备ELISA酶标板，根据检测的量包被抗原。 用包被液（pH9.6，0.05MNaHCO3-Na2CO3溶液）梯度稀释抗原，包被100 ul/孔，设置双复孔。 用保鲜膜密封酶标板，盖上盖，放在装有湿棉花的饭盒中，4过夜（16h-24h）。（二） 洗涤 取出酶标板，弃掉保鲜膜，甩掉其中液体，吸水纸上拍干。 加入洗涤液，300 ul/孔，震荡，室温放置3 min。甩掉其中液体，吸水纸上拍干。 共洗涤3次。 用纯水再洗两次。（三） 封闭 用PBS配制好5%的FBS溶液（封闭液，现用现配）。 洗涤后加入封闭液300 ul/孔。 保鲜膜密封酶标板，装饭盒中，37 培养箱2h。 封闭之后无需洗涤。（四） 一抗孵育 封闭快好前的30分钟准备好一抗（单克隆抗体），用封闭液稀释，稀释梯度1：1000，1：3000，1：9000，1：27000。同时设置空白组（空白封闭液），阴性对照组（未免疫细胞上清），阳性对照组（多抗）。 加入一抗100 ul/孔。 孵育：37，1h。（五） 洗涤（六） 二抗孵育 用封闭液稀释二抗，二抗稀释度是1：3000。 洗涤后，加入二抗，100 ul/孔。 孵育：37，45 min。（七） 洗涤（洗涤五次，再用纯水洗涤两次）（八） 底物显色 配制底物液（一块板用量，96孔，10 ml）：1甲液4.86 ml +1乙液5.14 ml + 4 mg OPD（3-4粒），迅速混匀。待充分溶解后加入30% H2O2 50ul 即可。注：OPD（邻苯二胺）有致癌性，操作时应戴手套。 底物液需现用现配，H2O2最后加，不然过一会儿就变黄了。 洗涤后加入底物液显色，100 ul/孔。 室温避光反应5-10 min。终止条件：目测阳性抗体孔已依次出现黄色，Blank孔尚无颜色时即可加入终止液。 预热酶标仪5 min。TMB显色用450 nm检测，OPD显色用492 nm检测。（九） 加入终止液 加入终止液（20%稀硫酸）50 ul/孔。（十） 酶标仪检测A492（Tecan公司，型号Sunrise） 加入终止液5 min内，上机检测。超过5 min检测有误差。ELISA反应中试剂配方：10PBS配制：100 ml NaCl8 g KCl 0.2 g Na2HPO412H2O3.58 g KH2PO4 0.24 g加入超纯水80 ml，充分溶解，HCl调节pH 7.2-7.4，超纯水定容至100 ml，过滤后4存放。包被液：1000 ml NaHCO32.93 g Na2CO3 1.59 g加入500 ml超纯水，调节pH值为9.6；补足超纯水至1000 ml。4存放待用。洗涤液：500 ml 10PBS 50 ml 超纯水450 ml Tween 200.25 ml封闭液：100 ml（现用现配） 10PBS10 ml FBS（胎牛血清） 5 ml 超纯水85 ml Tween200.1 ml样品稀释液：100 ml 10PBS10 ml 超纯水90 ml1甲乙液： 100 ml（甲、乙液分别提前配好，临用前再取所需量混合） 甲液： 柠檬酸1.92 g 超纯水溶解，定容至100 ml。 乙液： Na2HPO412H2O7.17 g 超纯水溶解，定容至100 ml。滤过除菌，4存放待用。临用前，取甲液4.86 ml与乙液5.14 ml混合，加OPD 4 mg（有毒，戴手套,4粒），待充分溶解后加入30%H2O250 ul，