微生物细胞数的计数-实验二.doc

实验二微生物细胞数的计数标准实验报告适用专业： 环境工程江苏科技大学生物与化工学院环境工程系2012年 8 月一、实验目的1.了解血球计数板的结构；2.掌握利用血球计数板计微生物细胞数的原理和方法二、实验要求1遵守实验室安全制度，听从指导教师安排；2认真听讲，不懂就问；3完成实验报告三、实验仪器和材料显微镜、血球计数板、移液管、盖玻片、吸耳球、酵母菌液（或其他微生物材料）等四、血球计数板的结构血球计数板是一种专门用于计算较大单细胞微生物的一种仪器，由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面刻有一个方格网。方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室。这一大方格的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，其容积为0.1mm3，即1mm1mm0.1mm方格的计数板；大方格的长和宽各2mm，深度为0.1mm，其容积为0.4mm3，即2mm2mm0.1mm方格的计数板。在血球计数板上，刻有一些符号和数字，其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25个中格；0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2表示计数室面积是1mm2，分400个小格，每小格面积是1/400 mm2。计数室通常也有两种规格：一种是1625型，即大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是2516型，即大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由1625=2516=400个小方格组成。11625型的计数板 将计数室放大，可见它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四个中方格（100个小方格）计数。将每一中格放大，可见25个小格。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：酵母细胞个数1mL=100个小方格细胞总数/ 100 40010000稀释倍数22516型的计数板 中央大方格以双线等分成25个中方格，每个中方格又分成16个小方格，供细胞计数用。一般计数四个角和中央的五个中方格（80个小方格）的细胞数。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：酵母细胞个数1mL 80个小方格细胞总数/ 80 40010000稀释倍数五、实验步骤及内容1. 取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。2. 取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。3. 静止5min后，用低倍镜观察并将计数室移至视野中央。 4. 在高倍镜下计数：随机计数五个中格的平均值，然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出一大格中的总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。酵母菌细胞数/mL= （X1+X2+X3+X4+X5）5 25（或16） 10 1000 稀释倍数 计数区如下：六、数据整理七、实验过程中应注意事项及心得1从试管中吸出培养液进行计数之前，要将试管轻轻震荡几下，这样使酵母菌分布均匀，防止酵母凝聚沉淀，提高计数的代表性和准确性，求得的培养液中的酵母菌数量误差小。2如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应当对培养液进行稀释以便于酵母菌的计数。具体方法是：摇匀试管，取1mL酵母菌培养液，加入成倍的无菌水稀释，稀释n倍后，再用血球计数板计数，所得数值乘以稀释倍数。以每小方格内含有45个酵母细胞为宜。特别是在培养后期的样液需要稀释后计数。3活酵母有芽殖现象，若芽体达到母细胞大小的一半时，即可作为两个菌体计数，若芽体小于母细胞一半时为1个酵母细胞。4对于压在方格界线上的酵母菌应当计数同侧相邻两边上的菌体数，一般可采取“数上线不数下线，数左线不数右线”的原则处理，另两边不计数。计数时，如果使用16格25格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格（即100个小格）的酵母菌数；如果规格为25格16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格（即80个小方格）的酵母菌数。5计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算，对每个样品可计数三次，再取其平均值。计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体。按公式计算每1ml（或10mL）菌液中所含的酵母菌个数。6血球计数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。八、思考题1. 当两种不同规格的计数板测同一样品时，其结果是否相同？答：相同2. 试分析影响本实验结果的误差来源并提出改进措施答：1. 样品要尽量纯净，杂质多会影响计数。2. 样品浓度要适中，太浓，不好计数， 太稀，计数不准确。以25*16的板子为例，计数的时候每次计4个角加中间共五个格子，每个格