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论文标题高效液相色谱法测定大黄中的大黄素、大黄酚的含量学生姓名 李海玲 班 级 药学30801 专业名称 药学 系部名称 制药工程系 指导教师 张利敏 提交日期 2010年12月5日 答辩日期 河北化工医药职业技术学院年 月目录摘要.3第一章：大黄的概述.3 1-1基本信息.3 1-2化学成分. 4 1-3药效作用.41-3-1消化系统的影响.41-3-2对血液系统的影响.41-3-3抗感染作用.51-4不良反应51-5现代研究5第二章：高效液相色谱法测大黄中大黄素和大黄酚的含量61-1仪器与试剂.61-1-1仪器.61-1-1试剂.62-2方法与结果. 72-2-1色谱条件.72-2-2对照品的制备.72-2-3供试品的制备.72-2-4阴性对照溶液的制备.72-2-5干扰试验.72-2-6标准曲线的绘制.72-2-7精密度试验.72-2-8重复性试验.72-2-9稳定性试验.72-2-10加样回收率试验.82-2-11样品的测定.8第三章：讨论.83-1药材含量测定中提取剂的确定.83-2HPLC法中检测波长的确定.83-3HPLC法中线形范围的确定.9参考文献.9第一章：摘要论文题目：高效液相色谱法测定大黄中的大黄素、大黄酚的含量摘要摘要内容：大黄是我国临床常用的中药之一，有“泻热通畅、凉血解毒、逐瘀通经、攻积导滞、利胆退黄”之功效，大黄中的有效成分有蒽醌类、芪类、苯丁酮类、鞣质类、色原酮类、萘类、有机酸、糖、蛋白质、甾醇等150多种成分。大量的研究表明，大黄的诸多制剂均以保存总蒽醌为目的。采用高效液相色谱法测定大黄中的大黄素、大黄酚的含量，结果可靠。采用高效液相色谱法测定大黄中大黄素和大黄酚的含量，色谱柱：Shim-Pack C18（4.6mm250mm,5m）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（8020）；流速：1.0ml/分；检测波长：254nm；柱温40；进样量10l。大黄素在0.43534.816g/ml浓度范围内,峰面积积分值与浓度呈良好的线性关系（r=0.9999）；大黄酚在0.96377.056g/ml浓度范围内,峰面积积分值与浓度呈良好的线性关系（r=0.9999），平均回收率为98.8%，RSD=0.8%(n=6)。本方法操作简单，结果可靠，与药典法没有显著性差异。关键词：高效液相色谱法，大黄素，大黄酚The content: rhubarb is used clinically of traditional Chinese medicine in China, is one of the spilled hot unobstructed, cool blood detoxification, by stasis given.it, tapping product guide sluggish, cholagogue retreat yellow function, the efficient components have rhubarb anthraquinone kind, Qi kind, butyl benzene ketone, tannic acid kind, color original ketone, naphthalene class, organic acids, sugar, protein, such as phytosterols 150 multiple components. A number of studies, many preparations are in dahuang save total anthraquinone is a purpose. By HPLC rhubarb of emodin, rhubarb phenolic content and results are reliable. By HPLC big HuangZhong emodin and rhubarb phenol, the content of chromatographic column: Shim - Pack C18 (4.6 mm x 250mm, 5 muon m), Mobile phase: methanol - 0.1% phosphoric acid (20); 80: Velocity: 1.0 ml/min, 254nm; detected wavelength: Column temperature 40 ; Incoming sample amount 10 mu l. Emodin in 0.435 34.816 muon g/ml concentration range, peak area with integral value is good linear relationship concentration (r = was 0.9999); Rhubarb phenol in 0.963 77.056 muon g/ml concentration range, peak area with integral value is good linear relationship concentration (r = was 0.9999), and the average recovery was 98.8%, RSD = 0.8% (n = 6). This method is simple operation, reliable results, with pharmacopoeial method, without significant differences. Keywords: high performance liquid chromatography, emodin, rhubarb phenol 第二章：大黄的概述第一节：大黄的基本信息药名：大黄 别名：将军、黄良、火参、肤如、蜀大黄、锦纹大黄、牛舌大黄、锦纹、生军、川军性味：苦，寒。 归经：胃经；大肠经；肝经；脾经 科属分类：蓼科 功效：攻积滞；清湿热；泻火；凉血；祛瘀；解毒 主治：实热便秘；热结胸痞；湿热 泻痢；黄疸；淋病；水肿腹满；小便不利；目赤；咽喉肿痛；口舌生疮；胃热呕吐；吐血；咯血；衄血；便血；尿血；蓄血；经闭；产后瘀滞腹痛；症瘕积聚；跌打损伤；热毒痈疡；丹毒；烫伤。 药材基源：为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的根和根茎。 用法用量：内服：煎汤，3-12g；泻下通便，宜后下，不可外煎；或用开水泡渍后取汁饮；研末，0.5-2g；或入丸、散。外用：适量，研末调敷或煎水洗、涂。煎液亦可作灌肠用。大黄生用泻下作用较强，熟用则泻下作用较缓而长于泻火解毒，清利湿热；酒制功擅活血，且善清上焦血分之熟；炒炭常用于凉血止血。 药材基源：为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的根和根茎。 资源分布：分布于陕西、甘肃东南部、青海、四川西部、云南西北部及西藏东部。第二节：大黄的化学成分化学成分大黄含有蒽类衍生物、苷类化合物、鞣质类、有机酸类、挥发油类等。 1. 蒽类衍生物分为： 游离蒽醌衍生物，如芦荟大黄素（aloe emodin）、土大黄素（chrysaron）、大黄酚（chrysophanol）、大黄素（emodin）、异大黄素（isoernodin）、虫漆酸D（laccaic acid D）、大黄素甲醚（physcion）、大黄酸（rhein）； 结合蒽醌化合物，有大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚的单和双葡萄糖甙；大黄素、大黄素甲醚的单糖甙；蒽酚和蒽酮合物：大黄二蒽酮（rheidin）、掌叶二蒽酮（palmidin）以及与糖结合的甙如番泻甙（sennoside）A、B、C、D、E、F等。 2. 苷类化合物：土大黄甙（rhaponticin）、3，5，4-三羟基芪烯一4-O-D-（6-O-没食子酰）葡萄糖甙（3，5，4-trihydroxy-stilbene4-O-D-（6-O-gallayl）-glucoside）、3，5，4-三羟基茋烯-4-O-D-吡喃葡萄糖甙（3，5，4-trihydroxy stilbene-4-O-D-glucopyranoside）。 3. 萘衍生物：torachrysone-8-O-D-glucopy ranoside，torachrysone-8-（6-oxaly）-glucoside及决明松（torachryson）。 4. 鞣质类：没食子酰葡萄糖、d-儿茶素、没食子酸、大黄四聚素（tetrann）等。大黄四聚苯经水解，得没食子酸、肉桂酸及大黄明（rheosmin）。此外合有树脂。 尚含有有机酸：苹果酸、琥珀酸、草酸、乳酸、桂皮酸、异丁烯二酸、柠檬酸、延胡紊酸等。 大黄中还含有挥发油、脂肪酸及植物甾醇等。第三节：大黄的药效作用对消化系统的影响（1）泻下作用： 作用表现：一般在服药后610小时排出稀便。 泻下有效成分：认为主要是番泻甙类。 泻下作用机理：番泻甙在肠道细菌酶的作用下分解产生大黄酸蒽酮，大黄酸蒽酮可刺激大肠粘膜，使肠蠕动增加而泻下。另外还可抑制肠细胞膜上Na+、K+ATP酶，阻碍Na+转运，使肠内渗透压升高，保留大量水分，促进肠蠕动而泻下。 （2）利胆、保肝 （3）促进胰液分泌、抑制胰酶活性 （4）对血液系统的影响（1）止血作用： 特点：作用确切、见效快。 止血有效成分：-儿茶素、没食子酸。 止血作用机理：促进血小板的粘附和聚集功能；增加血小板数和纤维蛋白原含 大黄量；降低抗凝血酶活性；使受伤局部的血管收缩 （2）降血脂： 降低总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白及过氧化脂质。 抗感染作用（1）抗病原微生物作用： 抗菌谱： 敏感的细菌有葡萄球菌、溶血性链球菌、淋病球菌、白喉杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌等。 敏感的病毒有流感病毒、孤儿病毒、乙肝病毒、脊髓灰质炎病毒等。 其他敏感微生物有阿米巴原虫、阴道滴虫、血吸虫及钩端螺旋体等。 抗菌有效成分：大黄酸、大黄素、芦荟大黄素。 抗菌作用机理：影响叶酸的酶系统；抑制细菌核酸和蛋白质合成；抑制细菌生物氧化酶系统；诱生干扰素。 （2）抗炎、解热作用 （3）免疫调节：蒽醌衍生物可抑制非特异性免疫功能。 (4) 抗衰老抗氧化作用，国内外越来越多学者证明，大黄所含鞣质有很好的抗氧化作用！第四节：大黄的不良反应大黄除可引起胃肠道反应外，曾有报道2例老年患者因长期服用(2年)大黄苏打片，每日15-21片，引起严重的缺铁性贫血，血红蛋白下降到5-5.6g，当减少用药量并补充铁等维生素C后恢复正常。通过炭末在肠道内转运时间和排泄时间研究以及肠道内水分测定等证明，大黄作用部位在大肠，是一种大肠性致泻剂，而铁主要在大肠中吸收，认为导缺致铁的原因可能为，大黄导泻作用干扰了铁的吸收；大黄鞣酸可能与Fe结合成不溶性复合物，妨碍了吸收；苏打中和了胃酸；干扰了铁与维生素C螯合，妨碍了铁的吸收。还有报道1例哮喘病人服大黄苏打4片后，出现皮肤痒疹、红斑，哮喘加重，经斑贴试验证实为大黄致敏。第五节：现代研究主要成分:大黄中具有致泻作用的主要成分是蒽醌甙及双蒽酮甙, 其泻下作用较其相应甙元作用为强蒽醌甙有: 大黄酚-葡萄糖甙（Chrysophanol-monoglucoside）或大黄酚甙（Chrysophaein）、大黄素-葡萄糖甙（Emodin- -monoglucoside）、芦荟大黄素-葡萄糖甙（Aloe-emodin-monoglucoside）、大黄素甲醚葡萄糖甙（Physcion monoglucoside）、大黄酸-葡萄糖甙（Rhein-monoglucoside）；掌叶大黄中还含有大黄素双葡萄糖甙（Emodin diglucosi- de）、芦荟大黄素双葡萄糖甙（Aloe-emodin diglucosi- de）、大黄酚双葡萄糖甙（Chrysophanol diglucoside）双蒽酮甙有番泻甙A、B、C、D、E、F（Sennoside A、B、C、D、E、F）大黄的致泻效力与其中的结合性大黄酸含量成正比, 游离的蒽醌类成分无致泻作用番泻甙的泻下作用较蒽醌甙为强, 但含量则远较后者为少 游离型蒽醌类主要有: 大黄酚（Chrysophanol）、大黄素（Emodin）、大黄素甲醚（Physcion）、芦荟大黄素（Aloe-emodin）、大黄酸（Rhein） 大黄又含有大黄鞣酸（Rheum tannic acids）及其相关物质, 如没食子酸（Gallic acid）、儿茶精（Cate- chin）、大黄四聚素（Tetrarin）此类物质有止泻作用 此外, 大黄尚含有脂肪酸、草酸钙、葡萄糖、果糖和淀粉 研究表明:大黄的有效成分口服后, 在消化道内被细菌代谢为具有生物活性的代谢产物而发挥泻下作用亦有研究证明: 大黄发挥泻下作用的另一途径是番泻甙由小肠吸收后, 经肝脏转化为甙元, 再刺激胃壁神经丛而引起大肠蠕动致泻, 同时一部分以原型或甙元随血转运到大肠, 刺激黏膜下神经丛和更深部肌肉神经丛等, 使肠运动亢进, 引起泻下大黄的泻下成分能排泄于乳汁中, 乳妇服用后可影响乳婴, 引起婴儿腹泻大黄具有兴奋和抑制胃肠的双重作用, 前者的物质基础是番泻甙, 后者的物质基础是鞣质类实验表明: 大黄汤对小鼠的胃肠道初期呈运动亢进, 后期呈运动抑制, 低浓度促进, 高浓度抑制大黄中所含之鞣质对胃肠运动有抑制作用, 故在产生泻下作用后可出现便秘大剂量使用大黄（g）时, 产生泻下作用；小剂量使用大黄（.g）时则出现便秘, 其机制与大黄中所含鞣质的收敛作用掩盖了含量过少的泻下成分的作用有关 临床研究证明:生大黄和熟大黄治疗急性上消化道出血, 均有良好的止血效果, 相同剂量下生大黄的作用更明显, 但熟大黄对胃肠道反应小, 可大剂量应用生、熟大黄治疗急性细菌性痢疾, 与西药组疗效一致, 但熟大黄组副作用小, 患者康复快大黄含苦味质, 服用小剂量粉剂（.g ）可促进胃液分泌而有健胃助消化作用第三章：高效液相色谱法测定大黄中大黄素和大黄酚的含量3.1 仪器与试剂11 仪器仪器：日本岛津2010AHT高效液相色谱仪，Class-vp工作站，日本岛津UV260紫外分光光度计，北京赛多利斯天平有限公司BP211D电子分析天平，济宁市中区鲁超仪器厂LC-250超声清洗机（250W 50kHZ ）。12 试剂 试药：大黄素对照品（批号：0756-200110 供含量测定用）、大黄酚对照品（批号：110796-200310 供含量测定用）均由中国药品生物制品检定所提供，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水， 中国大黄生药材为市售（产地为甘肃、四川）。3.2 方法与结果21 色谱条件色谱柱：Shim-Pack C18（250mm4.6 mm, 5m）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（8020）；流速：1.0ml/分；检测波长：254nm；柱温40；进样量10l。在此色谱条件下，大黄素的保留时间为12.44分钟，大黄酚的保留时间16.43分钟。大黄素的理论板数为11 265，大黄酚的理论板数为12 286。22对照品溶液的制备：精密称取大黄素、大黄酚对照品各5mg，分别置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密量取大黄素溶液1ml、大黄酚溶液2ml，分别置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（大黄素每1ml中含4g、大黄酚每1ml中含8g）。 23供试品溶液的制备：取本品粉末(过四号筛)约0.1g同时另取本品粉末测定水分(附录H 第二法)，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加甲醇25ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤5ml，置50ml圆底烧瓶中，挥去甲醇，加2.5mol/L硫酸溶液10ml，超声处理5分钟，再加氯仿10ml，加热回流1小时，冷却，移置分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液用氯仿提取2次，每次约8ml，合并氯仿液，以无水硫酸钠脱水，氯仿液移至100ml锥形瓶中，挥去氯仿，残渣精密加甲醇10ml，称定重量，置水浴中微热溶解残渣，放冷后，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。24阴性对照溶液的制备：取缺大黄的阴性样品适量，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。25干扰试验：取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液按上述色谱条件测定。样品色谱图中与对照品溶液有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照溶液在此保留时间无此峰，说明大黄的其他成分对大黄素和大黄酚的测定无干扰。证明本法可行。26标准曲线的绘制：分别精密吸取大黄素对照品储备液（每1ml含4g）各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml和大黄酚对照品储备液（每1ml含8g）各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml分别置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件进行测定，以峰面积A对对照品浓度C作线性回归。得大黄素回归方程为：A=39 832C+4229.6，r=0.9999；大黄酚回归方程为：A=53 988C-352.27，r=0.9999。结果表明，大黄素在0.4010.00g/ml范围内呈良好的线性关系。大黄酚在0.8020.00g/ml范围内呈良好的线性关系。27精密度试验：取样品测定项下配制的供试品溶液在一日内不同时间连续重复进样6次进行HPLC分析测得日内精密度和连续7日内进行HPLC分析测得日间精密度。日内测得大黄素峰面积RSD值为1.2%（n=6）；大黄酚峰面积RSD值为0.5%（n=6）。日间RSD分别为1.3%和0.7%。见表1、2。表1 日内精密度（略）28重复性试验：称取同一样品6份，按照供试品溶液制备项下方法制备，按上述色谱条件测定，并计算含量，结果大黄素和大黄酚RSD分别为0.97%和0.48%。29稳定性试验：称取样品1份，按照供试品溶液制备项下方法制备，按上述色谱条件测定，每隔2小时进样1次，测得峰面积并计算，结果大黄素24小时内的RSD为1.4%（n=12），大黄酚24小时内的RSD为0.9%（n=12），结果表明样品溶液在24小时内测定结果稳定。210加样回收率试验：取已知含量的大黄生药材0.5g，分别加入对照品溶液适量，按上述色谱条件测定，计算回收率。大黄素在0.43534.816g/ml浓度范围内峰面积积分值与浓度呈良好的线性关（r=0.9999）；大黄酚在0.96377.056g/ml浓度范围内峰面积积分值与浓度呈良好的线性关系（r=0.9999），平均回收率为95.6%，RSD=1.2%(n=6)。3.3样品测定31 样品的测定将样品研成细粉，准确称取0.5g左右，置碘量瓶中加入甲醇30ml，超声提取30分钟，提取物过滤，溶剂减压蒸干，残渣用5ml甲醇溶解，经微孔滤膜过滤后取10l注入HPLC中，带入回归方程，用外标法测定含量。同时，按药典（2000版）附录IXH水分测定法测定含水量。将样品按样品测定项下规定进行测定，同时按药典法（2000年版药