甲硝唑与牛血清白蛋白相互作用的电化学行为研究.doc

甲硝唑与牛血清白蛋白相互作用的电化学行为研究刘杰1*，张波1，刘艳梅2，张勇2 (1.太原中心医院 太原030009 2.山西大学化学化工学院，山西 太原 030006)摘要 目的:采用电化学方法研究了甲硝唑与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用的电化学行为。方法:循环伏安法和线性扫描伏安法。结果: 在pH8.5的Britton-Robinson缓冲溶液和0.6 molL-1氯化钾溶液组成的底液中，甲硝唑在-0.57V(s.SCE)处出现一灵敏的还原峰，而牛血清白蛋白(BSA)在扫描范围为-0.3-0.8V处没有峰。而且，当BSA加入到甲硝唑溶液中，甲硝唑的还原峰明显降低，实验证明还原峰的降低值与BSA加入的浓度呈线性关系，线性范围为5.010-71.010-4 molL-1， (r=0.995)，检出限为8.010-8molL-1。并对甲硝唑和BSA的相互作用机理进行了探讨，二者主要通过疏水键相结合。结论: 测定了甲硝唑与BSA的结合比和结合常数, 并对结合反应机理进行了初步的探讨。 关键词：甲硝唑；牛血清白蛋白；电化学行为；相互作用中文分类号: 文献标识码: 文章编号:Study on the interaction between metronidazole and bovine serum albumin using electrochemical methodLIU Jie , ZHANG bo,(Department of pharmacentics,The Central Hospital of Taiyuan.Taiyuan 030009) LIU Yan-mei , ZHANG Yong* (School of Chemistry and Chemical Engineer, Shanxi University, Taiyuan 030006)Abstract Objective: The electrochemical methods has been used for study on the interaction between metronidazole and bovine serum albumin. Methods:Cyclic voltammetry and linear sweep voltammetry. Results: The results showed that a sensitive reduction peak of metronidazole has been obtained in the base solution of Britton-Robinson buffer solution (pH8.5) and 0.6 molL-1 KCl solution, but bovine serum albumin has not reduction peak in the rang of -0.3-0.8V. When bovine serum albumin was added in metronidazole solution, the reduction peak of metronidazole will fall down. The peak current declining value was directly proportional to the bovine serum albumin concentration in the rang of 5.010-71.010-4 molL-1 (r=0.995). The detection limit was 8.010-8 molL-1. In addition, the interaction mechanism between metronidazole and BSA has been studied, the results demonstrate that combination of them mainly by hydrophobicity. Conclusion: The binding ratio and binding constant of metronidazole with BSA calculated. Furthermore , the binding mechanism was also preliminarily discussed.Key Words: metronidazole; bovine serum albumin; electrochemical behavior; interaction蛋白质的定量测定是生物化学、药学、食品检验及临床分析中常涉及的重要内容, 目前蛋白质的定量测定主要是光谱探针法1-8 。近年来,电化学法由于其简便、快速、价廉, 在生命科学领域内日益受到重视9-11 。本文用电化学分析方法对甲硝唑和BSA之间的相互作用进行了研究。建立了一种测定BSA的新方法，并对结合反应机理进行了初步探讨12,13。1 仪器与试剂LK2005型电化学工作站(天津兰力科化学电子高技术有限公司)；三电极体系：参比电极为饱和甘汞电极(SCE)，辅助电极为铂丝电极，工作电极为银盘电极(：50m天津兰力科化学电子高技术有限公司)。甲硝唑标准储备溶液（1.010-3 molL-1）： 准确称取0.0171g甲硝唑（太原制药厂，质量分数99.5%），用二次蒸馏水溶解并定容于l00mL容量瓶中，置于棕色试剂瓶中于冷暗处保存；牛血清白蛋白(BSA) （Sigma公司，分子量：68000）；pH8.5的Britton-Robinson缓冲溶液；1.2 molL-1氯化钾溶液。(其它试剂均为分析纯，实际用水为二次蒸馏水。)2 实验方法电极预处理：先用小号金相砂纸将银盘电极磨平滑，再在稠布上用Al2O3粉末抛光成镜面，然后在超声波水浴中依次用水和乙醇彻底清洗。循环伏安法电化学测量：在10 mL 的比色管中，依次加入1 mL 0.1 molL-1 pH 8.5的Britton-Robinson缓冲溶液，1.2 molL-1氯化钾溶液5mL，0.5 mL 1.010-3 molL-1甲硝唑和不同浓度的BSA，用水定容至刻度，匀后室温下静置25 min，以未加BSA 的甲硝唑溶液作参比进行研究和测定。3 结果与讨论3.1线性扫描伏安图的变化对甲硝唑与BSA 二者的反应体系进行了电化学研究。在pH8.5 的Britton-Robinson缓冲溶液和0.6molL-1KCl溶液组成的底液中， BSA 在-0.3 -0.8 V 扫描范围内无峰。甲硝唑在此范围内有一灵敏的还原峰，峰电位约为-0.57 V(s. SCE)。当将BSA加入到甲硝唑溶液中后，甲硝唑还原峰电流减小，甲硝唑峰电流的降低值与加入BSA 的浓度在一定范围内呈良好的线性关系可用于BSA 的定量测定。如图1为甲硝唑浓度5.010-5 molL-1时加入不同浓度BSA的线性扫描叠加伏安图。图1 BSA-甲硝唑反应的线性扫描伏安图Fig. 1 Linear sweep voltammogram of reaction system of BSA - Metronidazole (pH8.5)a. 5.010-5 molL-1甲硝唑; b. a+BSA 1.010-5 molL-1; c. a+BSA 2.010-5 molL-1; d. a+BSA 3.010-5molL-1.3.2实验条件的选择（1）缓冲介质和酸度的选择固定甲硝唑和BSA 的浓度分别为5.010 -5 molL-1 和1.010-5 molL-1，改变Britton-Robinson缓冲溶液的pH，考察酸度对反应体系的影响，结果表明在pH8.5的Britton-Robinson缓冲液中峰电流具有最大差值即ip 最大(如图2所示)。在10mL 测定溶液中, 分别加入0.53.0 mL Britton-Robinson缓冲液进行测定，当 Britton-Robinson缓冲液用量为1mL，峰电流灵敏度越高，ip 越大。实验选择Britton-Robinson 缓冲液加入量为1.0mL。图2 缓冲溶液pH对峰电流的影响Fig. 2 Effects between the pH and peak current（2）甲硝唑用量对反应体系的影响在pH 8.5 的Britton-Robinson 缓冲液中, 固定BSA 为1.010-5 molL-1 ,甲硝唑浓度为1. 010-5 1.010-4 molL-1 时对体系测定的影响。结果表明当甲硝唑浓度为5.010-5 molL-1时，ip 最大。所以选择甲硝唑浓度为5.010-5 molL-1。（3）试剂加入顺序对体系的影响分别改变Britton-Robinson、甲硝唑和BSA三种溶液的加入顺序, 测定体系的ip 。结果表明，先加入Britton-Robinson 缓冲液再加入甲硝唑溶液，最后加入BSA 的顺序ip 最大，故为最佳加液顺序。（4）反应时间对体系的影响实验测定了反应时间对甲硝唑和BSA 作用体系的影响。二者反应速度较快，25 min后ip 值达到最大，实验选择室温下放置25 min作为实验条件（如图3所示）。（5）扫描速度与峰电流的关系在50200mV/s范围内，反应体系的峰电流(ip)与扫速(v)之间均呈线性关系，线性相关系数为0.9995，说明还原峰性质为吸附还原峰（如图4所示）。（6）干扰物质的影响当BSA 的浓度为1. 010-5 molL-1 时，测定误差小于5% , 试验了常见的氨基酸如：L-异白氨酸、DL-缬氨酸、DL-丝氨酸、DL-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺和柠檬酸根、葡萄糖、HPO42-、H2 PO4- 及金属离子Ca2+、K+、Mn2+、Na+、Zn2+、Cr3+、Cu2+、Co2+、Mg2+等对BSA 测定的影响，结果发现上述物质对测定均产生一定的影响。少量的Ag+、Fe3+干扰较为严重。图3 反应时间对体系的影响Fig. 3 Effects between the reaction time level and reaction system图4 扫描速度与峰电流的关系Fig. 4Relationship between the scan rate and peak current3.3甲硝唑与BSA浓度的线性范围、检出限和线性相关系数在优化条件下，采用线性扫描伏安法测定了甲硝唑的峰电流下降值与BSA的浓度的关系线性范围为5.010-71.010-4 molL-1，线性回归方程为：ip=2.7459C(BSA)+0.1168(r=0.995, ip:A, C(BSA):10-5 molL-1)，检出限为8.010-8molL-1。对1.010-6 molL-1BSA平行测定了8次，其相对标准偏差为2.31%。3.4回收率试验在已知BSA浓度的体系中，再加入不同浓度的BSA，测定其回收率，测定结果见下表1。表1 回收率试验结果(n=6)Table 1 Result of recovery编号(NO.)原始样品量(10-6molL-1)加入量(10-6molL-1)测得量(10-6molL-1)回收率(%)10.800.501.29193.120.800.501.29799.731.000.501.512100.841.000.501.503100.251.100.501.609100.5261.100.501.59399.563.5甲硝唑与牛血清白蛋白反应体系结合常数和结合比的测定根据文献12，如果甲硝唑与BSA形成单一的复合物，那么该反应体系满足以下方程：MNZ + nBSA = MNZnBSA (1)由此可以推断结合常数：MNZnBSA/ MNZ BSAn (2)如果MNZnBSA复合物不具有电活性，那么甲硝唑还原峰电流的下降值与该复合物的浓度应呈线性关系：ip = kMNZnBSA (3)由此可以推断：C MNZ = MNZ + MNZnBSA (4)ip max = k C MNZ (5)ip max -ip = k(C MNZ -MNZnBSA ) = kMNZ (6)由上述式(3)、(6)、(2)可以推导出：ip / (ip max -ip) BSAn 或1/ip = 1/ip max + 1/ip max BSAn (7)式中, ip表示加入BSA 前后的峰电流降低的差值，ip max表示峰电流降低的最大差值。BSA表示牛血清白蛋白的平衡浓度。若只形成一种简单的复合物, 以1/ip1/ BSAn ( n = 1 , 2 , 3 ) 作图应为一直线, n 值即为结合比, 由直线的斜率的和截距可算出结合常数。结果表明, 如图5所示, 当n = 1 时1/ip1/ BSAn呈直线关系，线性方程为y = 1.5009x(105molL-1) + 0.2434，相关系数r =0.991。甲硝唑与BSA 形成11的复合物, 其结合常数= 2.24104 Lmol-1。图5 1/ip与1/ BSA关系图Fig.5 Plot of 1/ip versus 1/ BSA3.6甲硝唑与BSA反应机理的探讨蛋白质是通过肽键连接的氨基酸的多聚体。不同的氨基酸通过氢键、盐键、疏水作用力、共价键等作用构成了蛋白质的多级结构。药物分子与生物大分子的作用包括氢键、范德华力、静电引力、疏水作用等。药物不同，与蛋白质作用类型不同。由实验结果和文献13可知，甲硝唑主要通过疏水键与BSA发生结合反应。甲硝唑以疏水键和蛋白质相结合，可以在蛋白质中运输和储存，并有明显的生理活性，甲硝唑对蛋白质的构象有一定的影响，它们的结合服从位点结合模式，在298K时近似形成一个结合位点。参考文献：1 黄波，邹国林，杨天鸣. 阿霉素与牛血清白蛋白结合作用的研究J. 化学学报. 2004,60(10):18672 陶清，韩莉，徐金光，吕鉴泉. 诺氟沙星与牛血清白蛋白相互作用的拉曼光谱研究J. 河南科学,2007，25(3):3913 邱瑾, 邵爽, 游金宗. 荧光法研究奥沙利铂与牛血清白蛋白的相互作用J. 分析测试学报. 2007,26(7):514 邬春华, 吕元琦, 袁倬斌. 大黄酸与牛血清白蛋白相互作用的电化学研究J. 分析测试学报，2004，24(3):735 胡秋娈, 赵风林, 李克安. 以偶氮胂K光度法测定蛋白质J.分析测试学报, 2000 , 19(1) : 45 - 47.6 王海人, 肖忠柏, 宋功武, 等. 荧光素与牛血清蛋白作用的光谱研究与分析应用J . 分析测试学报, 2001 ,20(4) : 45 - 46.7 吴婧, 文凌飞, 朱兴旺, 等. 用铍试剂测定人血清白蛋白的分光光度法J . 分析测试学报, 1999 , 20(11) :1697 - 1702.8 WANG Y T, ZHAO F L , LI KA. 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