原核生物基因表达调控.doc

第六章 基因的调控1：原核生物基因表达调控第一节 概 述 机体能在基因表达过程的任何阶段进行调控，如调控可在转录阶段、转录后加工阶段和翻译阶段进行。转录的调控主要发生在起始阶段，这样可避免浪费能量合成不必要的转录产物。通常不在转录延伸阶段进行调控，但可在终止阶段进行调控，终止可以防止越过终止子而进行下一个基因的转录。RNA的初级转录产物本身是一个受调控的靶分子，转录物作为一个整体其有效性可以受到调控，例如，它的稳定性可以决定它是否保存下来用于翻译。此外，初级转录产物转变为成熟分子的加工能力可决定最后mRNA分子的组成和功能。在真核细胞中，还可对RNA从核到胞浆中的转运进行调控。但是在细菌中，mRNA只要一合成，就可用于翻译。翻译也像转录一样，在起始阶段和终止阶段进行调控。DNA转录的起始和RNA翻译的起始路线也很相似。 在原核生物和真核生物最常见的调控是转录过程的调控。因此本章先讨论转录调控，然后，再介绍翻译水平的调控。为了便于理解，在介绍具体的调控过程之前，先介绍一些基本概念。1顺式作用元件和反式作用因子 基因活性的调控主要通过反式作用因子(通常是蛋白质)与顺式作用元件(通常在 DNA上)相互作用而实现。基因是编码可扩散产物的DNA序列，基因所编码的产物可以是蛋白质(大多数基因都编码蛋白质)，也可以是RNA(tRNA和rRNA)。其最重要的特点是基因产物将从合成的场所扩散到其发挥作用的其他场所。游离基因产物扩散至其目标场所的过程称为反式作用trans-acting)。因此反式作用因子(trans-acting factor)的编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列不在同一个DNA分子上。顺式作用(cis-acting)的概念用于任一不转变为任何其他形式的DNA序列，它只在原位发挥DNA序列的作用，它仅影响与其在物理上相连的DNA。有时顺式调节序列最终发挥作用的分子不是DNA，而是RNA。因此，顺式作用元件(cis-acting element)是指对基因表达有调节活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处在一个DNA分子上的基因；同时，这种DNA序列通常不编码蛋白质，多位于基因旁侧或内含子中。2结构基因和调节基因 为了区分调控过程中的调控成分和其调控的基因，有时用结构基因和调节基因的概念。结构基因(structural gene)是编码蛋白质或RNA的任何基因。结构基因编码着大量功能各异的蛋白质，所编码的蛋白质有组成细胞和组织基本成分的结构蛋白、催化活性的酶和调节蛋白等。调节基因(regulatory gene)是参与其他基因表达调控的RNA和蛋白质的编码基因。 调节基因编码的调节物通过与DNA上的特定位点结合控制转录是调控的关键。调节物与DNA特定位点的相互作用能以正调控的方式(启动或增强基因表达活性)调节靶基因，也能以负调控的方式(关闭或降低基因表达活性)调节靶基因。DNA位点通常位于受调节基因的上游，但有时也有例外。3启动子和终止子位于转录单位开始和结束位置上的序列为启动子(promoter)和终止子(terminator)，两者都是典型的顺式作用位点。启动子位于基因转录起始点的上游，负责基因转录的起始。终止子能终止基因的转录。启动子和终止子是能受同一类反式作用因子识别的顺式作用元件，这一类反式作用因子就是RNA聚合酶。当然，两个位点也能各自结合一些特定的其他因子。4操纵基因和阻抑蛋白细菌的传统控制机制是负调控:即阻抑蛋白(repressor)阻止基因表达。在缺省的情况下(即无阻抑蛋白时),RNA聚合酶能够识别受调节基因的启动子，使这种基因得到表达。另一个叫做操纵基因(operator)的顺式作用位点与启动子相邻，操纵基因是阻抑蛋白的靶位点。当阻抑蛋白与操纵基因结合时，就会阻止RNA聚合酶启动转录，基因的表达因而被关闭。5转录因子 除了上述负调控，基因转录的调控也有正调控。在细菌中，正调控与负调控使用的频率也许大致相等，但在真核生物中，最常见的调控方式是正调控。参与正调控的反式作用因子就是转录因子(transcription factor)。转录因子是转录起始过程中，RNA聚合酶所需的辅助因子。典型真核基因的缺省状态(即无转录因子)是基因处于无活性状态，RNA聚合酶自身不能在启动子上起始转录。反式作用因子在启动子附近有作用位点，其中的一些或所有因子的结合使RNA聚合酶能起始转录。 正调控和负调控的共同点是调控蛋白都是反式作用因子，它通常识别位于基因上游的顺式作用元件。不同类型的调节蛋白识别不同的序列。尽管调节蛋白结合DNA的实际长度较长，但它仅识别DNA上很短的序列，一般小于1Obp。细菌启动子就是一个例子，尽管RNA聚合酶在转录起始时，覆盖大于7Obp的DNA，但其识别的关键序列是位于-35和-10中心处6个碱基的序列。原核生物和真核生物的基因组织差异很大，细菌的结构基因一般成簇排列，而真核生物基因则是独立存在。成簇排列的结构基因能受单一启动子共同控制，结果是整套基因或者都表达或都不表达。第二节 操纵子 原核生物的调控可发生在转录和翻译等不同阶段，但以转录水平调控为主。大肠杆菌的乳糖操纵子是目前转录水平最清楚的调控，转录水平调控的许多一般规律都源于对乳糖操纵子的研究。在细菌中编码功能相关的结构蛋白的基因常成簇排列在一起。例如，同一个代谢途径的酶的基因就常成簇排列。此外，除了参与代谢途径的酶以外，其他与该途径有关的蛋白质的基因也可能包括在此控制单元内。例如，负责转运小分子底物进入细胞内的蛋白质的基因有时就包括在这样的控制单元内。这样的控制单元就是操纵子(operon)。操纵子就是由操纵基因以及相邻的若干结构基因所组成的功能单位，其中结构基因转录受操纵基因(operator，或称操作子)所控制。操纵子中的全部结构基因从同一个启动子开始转录成单个mRNA分子。操纵基因则是操纵子的前端部分，它能和阻抑蛋白结合，控制有关操纵子的转录。因此操纵基因是顺式控制元件，阻抑蛋白是由调节基因表达出的蛋白质，是参与操纵子调节的反式作用因子。2.1乳糖操纵子的结构参与-半乳糖苷(如乳糖)的分解代谢的三个酶的基因就成簇排列，构成乳糖操纵子 (lactose operon, lac)。下图列出了乳糖操纵子的结构基因、相关的顺式作用调控元件及反式作用调节基因的组织排列。三个结构基因分别编码三种蛋白质。lacZ编码-半乳糖苷酶。-半乳糖苷酶是分子量约500kDa的四聚体，能催化-半乳糖苷水解，它能将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖。lacY编码-半乳糖苷透性酶，-半乳糖苷透性酶是分子量30kDa的膜结合蛋白，是-半乳糖苷转运系统的组成成分，参与-半乳糖苷进入细胞内的转运。lacA编码-半乳糖苷转乙酰基酶，-半乳糖苷转乙酰基酶催化将乙酰基团从乙酰辅酶A转移到-半乳糖苷上。lacZ或lacY突变能产生不能利用乳糖的lac基因型。lacZ突变导致酶失活，因而不能分解利用乳糖。lacY突变菌不能从培养基中吸收乳糖。令人不解的事，仍没有分离到lacA缺陷的细菌。细菌在含不能被分解的某些-半乳糖苷类似物的培养基中培养时，很可能乙酰化反应发挥作用，因为这种修饰可引起脱毒和外排。结构基因突变只引起其编码的特定蛋白失活，而调节基因突变则影响其控制的所有结构基因的表达。lacZYA基因的转录受lacI基因指导合成的调控蛋白的控制。lacI基因正好与结构基因相邻，但它不与结构基因属同一转录单位，它有自己独立的转录单位，含自己的启动子和终止子。lacI编码可扩散的产物，理论上，它不必位于结构基因附近，lacI基因移到其他任何地方都能很好地发挥作用，因此它属于反式作用调节因子。 乳糖操纵子的控制属负调控，也就是说调节蛋白关闭其转录。lacI的表达产物称为乳糖操纵子阻抑蛋白(lac repressor)，它的功能是阻止结构基因的表达。乳糖操纵子阻抑蛋白是由4个同样亚基组成的四聚体，每个亚基分子量为38kDa。一个大肠杆菌细胞中有大约10个阻抑蛋白分子。调节基因转录成单顺反子mRNA，转录的速度似乎只受其启动子与RNA聚合酶的亲和力大小的控制。阻抑蛋白通过与lacZYA基因簇开始处的操纵基因(用0lac表示)结合发挥功能。操纵基因位于启动子(Plac)和结构基因(lacZYA)之间。阻抑蛋白与操纵基因结合时，能阻止RNA聚合物在启动子上的转录起始。lac操纵基因是mRNA起始点上游-5bp至转录单位内+2lbp的序列，因此它与启动子的右末端重叠。2.2 小分子诱导物对阻抑蛋白活性的影响细菌需要快速应答环境的变化，营养供给随时都可能发生变化，其生存取决于从分解利用一种物质转换为分解利用另一种物质的能力，因此对细菌来说，灵活性就特别珍贵。当然，经济性也相当重要，因为如果一个细菌以放任能量消耗的方式去适应环境则有很大的弊端。在某种物质并不存在时，产生参与该物质代谢的各种酶，代价实在太昂贵。细菌的做法是当某种物质不存在时，并不合成该物质代谢通路中的酶，但随时准备这种物质一出现就可合成所需的酶。应答某种特定物质出现而合成特定酶的过程称为诱导(induction)，这种调控方式在细菌中很普遍，在单细胞真核生物(如酵母中)也存在。大肠杆菌乳糖操纵子是这种控制机制的最好范例。 当大肠杆菌在不含-半乳糖苷的环境中培养时，不需要-半乳糖苷酶，细胞内含的 -半乳糖苷酶很少，每个细胞不到5个分子。加入适宜的底物后，细胞内很快出现酶活性，2-3分钟内，一些酶就出现，且很快达每细胞5000个分子的水平。在适宜的条件下，-糖苷酶的量可达细胞总可溶蛋白的5%10%。如果底物从培养基中去掉，酶的合成很快停止到诱导前的水平。 lac mRNA极不稳定，其半衰期仅有约3分钟，这使得诱导能很快逆转。只要诱导物一除去，转录就停止，所有lac mRNA便在很短的时间内分解掉，细胞内的mRNA含量回到诱导前的基础水平。 这种快速应答环境营养成分变化的能力不仅表现在分解新底物方面，而且也用来关闭突然出现在培养基中的化合物的内源性合成，例如，大肠杆菌通过色氨酸合成酶(trptophan synthetase)催化合成色氨酸，但是，如果培养基中含有色氨酸，酶的合成立即停止。这种效应就是所谓的阻抑作用(repression)，它使细菌避免采用自身资源进行不必要的合成。诱导作用和阻抑作用都能对细菌的代谢能力进行调控。前者调节细菌使用某种物质的能力，后者调节合成特定代谢中间物的能力。每种调节的诱发剂都是小分子物质，或为酶底物，或为酶所催化合成的产物。如果某种小分子物质能够促使细菌产生酶将其自身分解，这种小分子物质就叫做诱导物(inducer)。如果某种小分子物质能够阻止细菌产生合成其自身的酶，这种小分子物质就叫做辅阻抑物(corepressor)。诱导物或辅阻抑物的作用是高度特异的，仅有特定或密切相关的分子能发挥作用。但是这些小分子并不直接与其调控的目标酶分子相互作用而实现其调控功能。-半乳糖苷酶的一些诱导物与天然诱导物相似，但不能被酶分解。例如异丙基硫代-D-精苷 (isopropylthio-D-galactoside，IPTG)，尽管不能被-半乳糖苷酶识别，但它是乳糖操纵子非常有效的诱导物。这种能诱导酶合成，但不能被酶分解的分子称为义务诱导物(gratutious inducer)。义务诱导物由于能在细胞内保持原型不变，因此很有用，而真正的诱导物会被代谢分解掉，从而影响对系统的研究。用义务诱导物进行研究得到了一个重要结论:在诱导系统中，一定有一些与精确识别特异底物的酶分子不同的成分，这些成分能识别与底物相类似的分子，而酶不能。在乳糖操纵子中，这种应答诱导物的成分就是lacI编码的阻抑蛋白。它在应答环境变化时控制结构基因lacZYA转录的作用。三个结构基因从lacZ上游的启动子开始转录成一条mRNA。阻抑蛋白的状态决定启动子是开启还是关闭。缺乏诱导物时，由于阻抑蛋白具有结合操纵基因的活性，结构基因不被转录。而加入诱导物后，阻抑蛋白转变成非活性形式而离开操纵基因，因此转录从启动子开始，并通过结构基因，一直转录到位于lacA边上的终止子。这种控制回路的关键在于阻抑蛋白的二重性:它既能阻止转录，又能识别小分子诱导物。阻抑蛋白上有二个结合位点，一个是操纵基因结合位点，另一个是诱导物结合位点。当诱导物与它的结合位点结合后，改变了阻抑蛋白质的构型，从而影响操纵基因结合位点的活性。 诱导实现协同调节(coordinate regulation)，这种调节中所有受调节的基因作为整体表达或不表达。mRNA从5端依次翻译，这解释了为什么诱导总是引起-半乳糖苷酶、-半乳糖苷酶透性酶和半乳糖苷转乙酰基酶依次出现，共用的mRNA的翻译解释了为什么在不同的诱导条件下三种酶的相对量总是保持不变。诱导是基因表达的开关，虽然不同的诱导物诱导效率不同，但这些因子只影响转录和翻译的绝对水平，并不影响三种基因的相互关系。操纵子组成成分中有一个矛盾，乳糖操纵子含有编码分解该糖所需的半乳糖苷酶的结构基因(lacZ)，也包括编码负责转运底物进入细胞的蛋白的基因(lacY)。但是如果操纵子处于阻抑状态，诱导物怎样进入细胞开始诱导过程呢？两个方面的机制保证了细胞内总有小量的蛋白，足以开始诱导，一是操纵子有一基础水平的表达，即使不被诱导时，操纵子也有少量表达(诱导水平的0.1%)；另一个机制是一些诱导物通过其他吸收系统进入细胞内。乳糖操纵子模型的主要内容:Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA所编码。这个mRNA分子的启动子紧接着O区，而位于I与O之间的启动子（P）不能单独启动合成-半乳糖苷酶、-半乳糖苷透性酶、-半乳糖苷乙酰基转移酶（-半乳糖苷转乙酰酶）。操纵基因是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。当阻遏物与操纵基因结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制。诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lac mRNA的合成，也就是说，有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。2.3 正调控和负调控正调控和负调控是根据在无调控蛋白的情况下，操纵子应答的结果来确定的。两种控制系统的特性有镜像关系。在负调控系统中，如果不被阻抑蛋白关闭，基因就能表达。任何干扰基因表达的作用都是负调控，这些调控有一个共同点：即一个阻抑蛋白或与DNA结合，阻止RNA聚合酶启动转录，或与mRNA结合阻止核糖体启动翻译。负调控是一个万一安全(fail-safe)的机制。即万一调控蛋白失活，调控系统便发挥功能，使细胞能够合成这些酶。因此，很容易理解负调控是如何进化的。最初，系统呈现组成型表达，随后，细胞中产生一种干扰这种表达的机制而给细胞提供了选择优势，这种优势就演化成负调控系统。受正调控机制调控的基因，仅当活性调控蛋白存在时，才可能表达。正调控中控制特定操纵子的机制正好与负调控对应。正调控与负调控不同，它不妨碍起始，而调控蛋白对正调控来说，则必不可少。调节蛋白与DNA及RNA聚合酶相互作用，协助转录起始。正调节蛋白应答的小分子通常称为激活物(activator)。另一种正调控则进行全局性替换 因子，改变启动子的选择性，或进行全局性替换抗终止因子，从而改变终止子的识别。了解正调控的进化过程较了解负调控的更困难，因为甚至在任何调控存在之前，细胞也肯定具有表达这些被调控的基因的能力，可以推测，此控制系统的一些成分的作用肯定发生了变化。也许，原来它是基因表达装置的调节部件，后来变成仅局限于对某些系统或某个特定系统发挥作用。根据应答调节其表达的小分子的性质，操纵子分为诱导型(inducible)和阻抑型(repressible)两类。只有在小分子诱导物存在时，诱导型操纵子才能发挥作用；只有在小分子辅阻抑物(corepressor)不存在时，阻抑型操纵子才能发挥作用。描述阻抑型系统中操纵子活性状态的术语是去阻抑(derepressed)，去阻抑与诱导有同样的含义。有时将不能去阻抑的突变操纵子称为超去阻抑(super-derepressed)，与不可诱导型完全对应。通过利用调控蛋白与小分子诱导剂或辅阻抑物适当的相互作用，无论是正调控还是负凋控都能实现诱导或阻抑。当诱导物使阻抑蛋白失活或使激活物蛋白激活时，实现诱导。当辅阻抑物使阻抑蛋白激活或使激活物蛋白失活时，则实现阻抑。调节蛋白失活的遗传结果能用于区别正调控系统和负调控系统。阻抑蛋白的失活产生代表负调控系统的隐性组成型或去阻抑型表型。另一方面，使激活物失活的突变，形成代表正调控系统的隐性不可诱导型或超阻抑型表型。色氨酸操纵子是阻抑系统的一个实例。色氨酸是一系列生物合成酶催化反应的终产物。细胞内色氨酸的水平控制色氨酸酶的合成和活性。在这些调控中色氨酸起激活阻抑蛋白的辅阻抑物的作用，这是经典的阻抑机制。当环境中的色氨酸丰富时，由于阻抑蛋白与辅阻抑物复合物与操纵基因结合，操纵子被阻抑。当环境中提供的色氨酸不足时，辅阻抑物失活，与操纵基因结合的特异性下降，辅阻抑物贮存DNA的其他位点上，操纵子的阻抑被解除。清除阻抑蛋白能使trp启动子上转录起始的频率增加约70倍。即使在阻抑条件下，结构基因也以低的基础水平或称阻抑水平继续表达。在操纵基因上的阻抑效率较乳糖操纵子低得多。乳糖操纵子基础水平表达仅为诱导水平表达的千分之一。小分子引起调节蛋白变构也可实现诱导和阻抑。控制调节蛋白的活性也能达到调控的目的。其中的例子是OxyR，它是由过氧化氢诱导的一种基因转录激活剂。OxyR蛋白直接被氧化所激活。因此它提供了一种敏感的氧化应激检测手段。另一个常见的调控信号是调节蛋白的磷酸化。2.4 分解代谢产物阻抑作用对启动子的正调控到目前为止，我们一直把启动子看作一段DNA序列，它能与RNA聚合酶结合，从而起始转录。但是有一些启动子，如果没有辅助蛋白的协助，RNA聚合酶并不能在其上起始转录。因为要打开转录单位的开关，必须有这些蛋白存在，所以这些蛋白是正调控。已知几种正调控物，一些被噬菌体编码，一些存在于宿主细胞内。它们发挥作用的一种模型是激活物克服了低效率启动子效率低的问题，这些低效率启动子位于没有很好的保守序列的-35区或-10区。2.4.1 分解代谢产物的阻抑作用在大肠杆菌中，一种蛋白质控制着应答碳源条件的一大套操纵子的活性，这种蛋白质便是发挥作用最广泛的激活物之一。当葡萄糖作为能源时，它能比其他糖优先被利用。因此当大肠杆菌在培养基中发现葡萄糖和乳糖时，它分解利用葡萄糖，而阻抑乳糖的利用。这种选择是通过阻止包括乳糖操纵子、半乳糖操纵子和阿拉伯糖操纵子等的表达来实现的。这种作用被称为分解代谢产物阻抑作用(catabolite repression)。分解代谢产物的阻抑作用属于葡萄糖降低细胞内cAMP水平的调控系列环节。cAMP由腺苷酸环化酶(adenylate cyclase)催化合成。腺苷酸环化酶以ATP为底物，将核糖环上3、5两个碳原子通过磷酸二酯键连接。编码腺苷酸环化酶基因的突变(cya-)不能应答葡萄糖水平的变化。、2.4.2 分解代谢物激活蛋白(CAP)的功能cAMP通过与cap基因产物结合，使分解代谢物调控的操纵子的表达水平与cAMP水平成正比。cap基因产物称为分解代谢物激活蛋白(catabolite activator protein,CAP)。cap基因突变可阻止操纵子的激活，而在葡萄糖缺乏时，这些操纵子能被正常表达。CAP是一正调控因子，在依赖CAP的启动子上起始转录必须有CAP参与。只有cAMP存在时，CAP才有活性，cAMP起到了传统的小分子诱导物的作用。cAMP下降，CAP就不能与控制区结合，RNA聚合酶就不能启动转录。因此，葡萄糖降低cAMP水平的作用，实际上是使相关操纵子表达所需的调控因子失活，使操纵子不能被表达。 CAP因子可与DNA结合，从每个正常发挥作用的启动子上都能分离到cAMP-CAP- DNA复合物。CAP因子是由二个相同亚基构成的二聚体，每个亚基都含螺旋-转折-螺旋基序，分子量为2250ODa，能被单个分子cAMP激活。一个CAP亚基含有一个DNA结合区和一个转录激活区。2.4.3 CAP结合位点的结构CAP二聚体与其效应的启动子结合位点长约22bp。使CAP失去作用的突变通常位于保守的五碱基单位TGTGA/ACACT内，这些碱基是识别的基本元件。因为CAP二聚体的两个亚基有效地与DNA结合，所以与CAP结合最强的位点含两个反向重复的五碱基单位。然而很多结合位点缺乏第二个五碱基单位，因此，在这些结合位点上第二个亚基必须与不同的序列结合(如果与DNA结合的话)。与CAP结合亲和力的差异阐明了为什么在体内不同的基因受cAMP激活的水平不同。2.4.4 CAP结合位点与转录起始点的位置关系不同操纵子的CAP结合位点与转录起始点的相对位置不同。甚至TGTGA五碱基单位可处在启动子的不同方向上，有的在上游，有的在下游，有的在在中。下图的三个例子涵盖了CAP结合位点的三种情况： 有时CAP结合位点位于启动子内。例如gal基因座，CAP位点位于-50至-23bp处，中心在-4lbp处。由于CAP结合位点正好位于通常被RNA聚合酶保护的区域内，所以很可能仅有一个CAP结合，且与RNA聚合酶有很紧密的接触。CAP结合位点与启动子相邻，例如乳糖操纵子。在乳糖操纵子中，受CAP保护的DNA区域位于-72至-52bp处，中心在-6lbp处。很可能有两个CAP与其结合。其结合模式为:CAP主要结合在DNA的一个面上，RNA聚合酶也正好结合在此面上，CAP与RNA聚合酶正好相互挨着。 其他操纵子CAP结合位点位于启动子上游，如阿拉伯糖操纵子(ara)其CAP结合位点与一个CAP结合，距转录起始点远，位于-107至-78bp之间。因CAP和RNA聚合酶间有另一调控蛋白结合，故CAP不能与RNA聚合酶接触。对CAP的依赖与启动子本身的效率有关，非CAP依赖启动子有好的-35序列，但一些启动子没有好的-10序列。实际上，我们可以推论，如果启动子含有效的能独立与RNA聚合酶作用的-35区和-10区，CAP的有效调控将十分困难。2.4.5 CAP对RNA聚合酶的作用理论上CAP激活转录有两种方式，第一种是CAP直接作用于RNA聚合酶，另一种作用于DNA，改变其结构，以协助RNA聚合酶的结合。实际上，CAP对RNA聚合酶和DNA都有效。大多数启动子上的CAP结合位点与gal(中心在-4lbp)或lac(中心在-6lbp)相似。如其位置偏离这两处，CAP激活转录的能力下降。其位置的规律是仅当CAP与转录起始点相距数个整双螺旋时，才能激活转录。表明CAP必