双向电泳操作步骤.doc

3.1 全菌蛋白的制备将细菌接种于DMEM培养基，置于28培养箱培养18h。参照Coelho 等（Coelho et al. 2004）的方法，略有改动。用Wash buffer（10mmol/L TrisCl pH8.0，5mmol/L 醋酸镁）清洗细胞3次。离心，细胞沉淀在Lysis Buffer( 7mol/L 尿素， 2mol/L硫尿，1% IPG Buffer pH3-10或 pH4-7，4% CHAPS，1% DTT， 1%蛋白酶抑制剂，1%核酶抑制剂)中悬浮，使其浓度范围在510mg/mL。置于冰上裂解2h。13000r/min离心1h取上清，-80保存。用2-D clean-up Kit 纯化蛋白，再用2-D Quant Kit测定样本中蛋白浓度。3. 2 2-D Clean-Up Kit的使用方法 （全程小心）蛋白质样本在1.5mL微型离心管中处理，所有步骤均在冰上进行。1）将体积100L的蛋白质样本（含1100g蛋白质）置于1.5mL微型离心管中。加入300L沉淀剂。振荡或倒置搅匀。冰浴中（45）培育15min。2）加入300L共沉淀剂，简单振荡混合一下，12000r/min离心5min。3）将上清液尽量多地倾析或吸出，不要搅散沉淀。保持沉淀不变，在其上面加入一层40L共沉淀剂，冰上培育5min。后离心5min，去上清。4）往沉淀加入25L蒸馏水或去离子水。将管振荡510s，这时沉淀应散开，但并未溶解于水中。在管中加入1mL洗涤缓冲液（在-20下至少预冷1h）和5L洗涤添加剂，振荡直至沉淀完全散开。-20下培育至少30min，每10min振荡2030s。5）将离心管以最大速度（至少12000r/min）离心5min。小心地将上清液移走弃去。此时应可见白色沉淀，将沉淀简单风干一下（不要超过5min）。6）用裂解液溶解沉淀，以备第一向IEF电泳。振荡管子至少30s，在室温下孵育，振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。将离心管以最大速度（至少12000r/min）离心5min，去掉所有不溶物质，除去泡沫。上清液可以直接加载到第一向IEF 电泳胶上，也可以移至另一个管中，在-80下保存以备日后分析。3.3 2-D Quant Kit的使用方法1）用2mg/mL浓度的BSA 标准溶液制备标准曲线（050g）。2）制备含150L待测样本的微型离心管，一式两份。有效检测范围是0.550g。3）每个微型离心管中（包括含BSA 标准溶液的离心管）加入500L沉淀剂。振荡并在室温下培育 23min。4）加入500L辅助沉淀剂，短暂混匀。5）离心（至少10 000r/min）5min。弃去上清液。再次短暂离心将残余的上清液集中至管底，用微量移液管吸去残余的上清液。操作要快，避免离心沉淀再溶或分散开。此时应无可见的液体成分残留。5）每个管中加入 100L铜溶液和 400L蒸馏水或去离子水。振荡使沉淀的蛋白质溶解。应彻底振荡混匀，确保沉淀完全再溶解。6）每个管中加入 1mL工作比色剂，应确保以最快的速度加入，使之与样本立即相混。在室温下培育 1520min。采用分光光度计，如Ultrospec1100 pro UV/ 可见光分光光度计，测定样本和标准液的480nm波长吸光率。7）根据标准溶液蛋白质含量的吸光率，标绘标准曲线。将样本与标准曲线比较，得到样本蛋白质浓度。3.4双向电泳主要是依据GE Healthcare公司双向电泳操作手册进行，并参考GE Healthcare描述方法进行一些改进(Berkelman et al. 1998)。3.4.1 一向等电聚焦（IEF）13cm pH 3-10的胶条每胶条上样150g蛋白。24cm pH 4-7的胶条，每胶条上样300ug蛋白。胶条上样后于20水化l2h。水化好的胶条移至Ettan IPGphor III水平电泳仪按照：S100v 1h，S200v 1h，S500 v 1h，G1000v 1h，G10000v 3h，S10000v 8h至等电聚焦完成。等电聚焦结束后, 迅速取出IPG 胶条, 先置于平衡液A( 6 mmol/L Urea，2% SDS，75 mmol/L Tris-HCl pH8.8，29.3%甘油，1% DTT，痕量溴酚蓝) 平衡15min后，再将胶条置于平衡液B ( 6mmol/L Urea，2% SDS，75mmol /LTris-HCl pH 8.8，29.3%甘油，2.5%碘乙酰胺，痕量溴酚蓝)平衡15 min。3.4.2 二向SDS-PAGE（缓冲液全部是新鲜配制）将平衡好的胶条转入Ettan DALTsix垂直电泳槽中进行第二向电泳，聚丙烯酰胺凝胶浓度为12%，电泳条件为每胶1W ，电泳1h，然后每胶20W直至溴酚蓝指示线到达凝胶底部停止电泳。3.4.3 银染将凝胶在玻璃板上剥离下来后，置于固定液(40%无水乙醇)30min，倒去固定液，换敏化液(30%无水乙醇10%冰乙酸，0.2%硫代硫酸钠，6.8%的乙酸钠) )中敏化30min，倒去敏化液，以双蒸水洗3次，每次5min，然后置于银染液(0.25%硝酸银)中染色20min，再次用双蒸水洗2次，每次l min，接着置于显影液(2.5%无水碳酸钠，0.0084%甲醛)中至蛋白质点完全显现为止，倒去显影液，立即换终止液(1.5%乙二胺四乙酸二钠)停止显影，10min后用双蒸水洗涤3次，每次5min，然后置于保存液(30%无水乙醇，4.6%丙三醇)中，30min后再换一次保存液，此时凝胶就可以进行扫描和分析了。3.5 凝胶扫描及图象分析Image Scanner III型透射扫描仪对凝胶进行图象扫描。得到的双向电泳图谱通过ImageMaster 2D Elite 5.0 图像分析软件进行分析，所得数据的统计分析在SPSS11.0 软件上进行。水化过程： 从冰箱中取-20冷冻保存的水化上样缓冲液（不含DTT ，IPG Buffer）一小管（1ml/管），置室温溶解。 在小管中加入2.8mg DTT，IPG Buffer 5ul，充分混匀。 从小管中取出450ul水化上样缓冲液，加入(13cm pH 3-10的胶条每胶条上样150g蛋白)样品，充分混匀。 确保充分吸收，不要过量加入水化液。短暂离心。水化液加入溶胀盘。从冰箱中取-20冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7），室温中放置10分钟。分清胶条的正负极，从正极开始剥保护层，胶面朝下，除气泡，正极先放。注意：碱性（负极）端较脆弱，应小心操作。轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。在每根胶条上覆盖2-3ml覆盖油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。 胶条上样后于20水化l2-20h。 第一向等电聚焦水化结束后，调仪器水平，放胶条槽。胶条放与滤纸上，吸多余覆盖油。取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。放胶条，胶面朝上。加电极片，装电极片。将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加ddH2O 58l润湿。盖盖，设程序对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20冰箱保存。第二向SDS-PAGE电泳 配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水（没有milliq的话ddh2o也行）、封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水，用MilliQ水冲洗。 从-20冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。 配制胶条平衡缓冲液A。 5在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液A。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 配制胶条平衡缓冲液B。 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液A。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液B，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。 将琼脂糖封胶液进行加热溶解。 将10电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。 第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。 将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。 在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。 在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。 进行染色。双向电泳蛋白点的切取和保存1.用PDQuest软件或肉眼比对，找出感兴趣的蛋白点，并做好标记和记录。2.用MilliQ水冲洗胶2次。3.用色谱纯甲醇和MilliQ水冲洗Ep管4.将枪头(200l)下端剪去，使其内径略小于蛋白斑点的直径，用色谱纯甲醇和MilliQ水冲