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猪体细胞核移植的研究进展 体细胞克隆是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中， 使后者不经精子穿透等有性过程即被激活、 分裂并发育， 让核供体的基因得到完全复制，经过体外培养后，将发育良好的胚胎移植到动物体内的技术1。近年来，体细胞克隆猪在建立人的动物疾病模型和人类器官移植，进行基因工程药物生产和临床医学克隆治疗等方面具有巨大的应用潜力，己成为当今体细胞克隆研究的热点。1 国内外体细胞克隆猪的研究现状1997年“多莉”羊诞生，揭开了体细胞克隆的序幕。2000年，Polejaeva 等得到首例体细胞克隆猪之后，Onishi，Bet-thauser等，相继分别成功地得到了体细胞克隆猪。2003年，Sanghwan等克隆出了表达强荧光蛋白的转基因猪。Jagdeece等克隆出了敲除- 1，3- 半乳糖苷转移酶基因的克隆猪，从而为人类培育异种器官移植猪跨进了一大步。在国内，窦忠英等(1995)用胚胎细胞核移植产生6头猪；魏庆信等(1996)得到了胚胎细胞核移植猪；李光鹏等(1998)把猪体细胞胚胎的细胞核通过电融合移植到去核的体内和体外成熟卵母细胞中，出生了2头克隆猪。孙兴参等获得了猪卵丘细胞克隆囊胚。2003年冯秀亮得到了人体细胞和猪卵母细胞异种核移植囊胚2。尽管如此，猪的体细胞克隆效率很低，与其他动物相比核移植难度更大，这是因为猪的卵子体外成熟胞质成熟不完全，发育能力不如体内获得的卵子:胞质较黑，较难显微操作;胞质内富含脂滴，对温度极其敏感;至少需要四枚优质胚胎才能建立和维持妊娠等。许多有关环节的机制还不清楚。本文就影响猪体细胞核移植主要因素的研究进展情况进行了综述。2 供体细胞2.1供体细胞的来源 多种组织来源的体细胞如乳房上皮细胞、各种成纤维细胞、卵丘/颗粒细胞、输卵管上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、睾丸支持细胞、神经细胞都可以用于克隆动物，但来源于不同组织或细胞种类的细胞的重编程能力和核移植效率明显不同。有些种类的供核细胞虽然能够得到克隆囊胚，但没有获得克隆后代。以克隆猪为例，目前只有猪的胎儿成纤维细胞和卵丘/颗粒细胞作为供体细胞成功地获得了核移植后代。Keefer CL（2002） 等比较了不同组织来源的体细胞作为供核细胞，在山羊克隆过程中对核移植后胚胎发育潜能的影响。其中，成年山羊颗粒细胞作为供核细胞得到7.7%的产仔率，而以胎儿成纤维细胞做为供核细胞则得到3.7%的产仔率，明显低于颗粒细胞克隆效率。张德福（2006）等对比了成纤维细胞、颗粒细胞、输卵管上皮细胞等，发现成纤维细胞和颗粒细胞形成重构胚后囊胚发育率较高。Kato Y（2000）等分别以雌性牛的卵丘细胞、输卵管、子宫细胞、雌性牛及雄性牛的皮肤细胞、雄性牛的耳成纤维细胞及肝细胞为供核细胞，共得到24只克隆牛。当以子宫、皮肤、耳部和肝脏细胞作为供核细胞时，19只出生克隆牛中有9只牛的体重超过正常范围的 40%；当以卵丘或输卵管细胞为供核细胞时，新生小牛无形态异常现象，其初生重也在正常范围内3。2.2 供体动物年龄 多数研究表明，在核移植过程中，采用来源于胚胎和新生动物的细胞作为供核细胞，其克隆胚胎具有相似的囊胚发育率，但胎儿细胞却更容易得到健康的新生动物。这可能是由于胎儿细胞的分化程度较低，在重组胚中更容易启动重编程。而成体动物由于年龄较大，体细胞分化程度高，积累了较多的损伤和突变，因此导致重组胚胎发育能力降低。但也有研究认为，体细胞克隆胚胎的发育率与供体细胞动物的年龄无关，如在牛的体细胞核移植中，采用2-16 岁的牛体细胞的克隆效率差异不大。但 Kato（2000）也用来自成体牛的细胞作为核供体，重组胚胎经移植后更容易在受孕后期发生早产，并且出生的小牛有缺陷的比率较高。有研究发现，体细胞核移植供体细胞的代数对核移植的效率存在一定的影响(Kubotaetal，2000)，牛供体细胞传代多次后有助于克隆胚胎的发育。在1-10代内不影响猪重构胚的发育能力(张运海，2005)。有研究大于10代以上的供体细胞比10代以下的供体细胞的重构胚发育能力低 (LEESAB-SANG，2003)。大多数，所采用的供体细胞多数是来源于传代3-9代的细胞作核供体 (Wilmutetal， 1997;Kato et al，1998;wells et al，1999;Hill et al,2000;Reggso et al，2001)。采用传代早期的细胞，这样似乎更有利于核移胚的发育。张运海博士研究表明采用6一9代的供体细胞重构胚的发育能力较佳。有研究5一15代之间重构胚发育能力差异不显著(Kubota，et al，2000)。Kasinathan等(2001)采用18代细胞为供核，不影响核移植重组胚的发育潜力4。2.3 供核细胞的细胞周期一般认为，供体细胞的细胞周期也是影响核移植的一个重要因素，只有供核细胞和受体卵母细胞的细胞周期相协调时，卵母细胞的胞质才能有效对移入的核发生去分化，并重新激活它的发育程序。当核供体进入M期卵母细胞质后经过激活，会发生移入核的核膜崩解（NEBD）、染色体超前浓缩（PCC）、核仁分散、核膜重新出现和类原核的形成（PN）以及原核膨大等一系列形态学变化。在动物核移植研究之初，认为供体核应该处于G1期或G0期，因为处于G0 和G1 期的供体细胞不会因为 DNA 复制而产生多倍体。而G2细胞的DNA己经合成，当用G2期细胞作为核供体时，其中的DNA会再次复制产生两个多倍体的子细胞；而S期细胞中有些DNA已复制，会导致克隆胚发育不正常5。但在随后的研究中，Wakayama（2006）等利用G1和G2/M 期供核细胞成功克隆出了小鼠，后赖良学等研究发现G2/M期的细胞能在去核MII期的猪卵母细胞中重新编程，并获得了体细胞克隆猪。此外，其他人的研究证实，G1、G2、M期的细胞均可用于核移植6。目前，除S期外，处于其它任何细胞周期的细胞都能成功用于克隆。尽管如此，目前大多数实验仍是采用血清饥饿法和接触抑制法获得的 GO/Gl 期细胞，认为这种细胞较其他细胞周期的细胞更有利于重编程。但 Lanza（2000）等认为8，目前并没有一种能伴随核移植动物出生的细胞周期专一性标记物，用于证明核移植的后代一定是来源于某一特定时期的供核细胞。3 受体细胞3.1 卵母细胞的选择 猪卵母细胞体外成熟培养及体外发育能力与成熟液和培养条件有密切的联系。现在普遍用两种基本的成熟培养基础液NCSU- 23和TCM199。一种成熟培养液由无BSA的 NSCU- 23添加其它营养物质和激素组成，而另一种由TCM199添加其它营养物质和激素组成。有人比较两种培养液的成熟效果，发现两者在成熟率上不存在显著差异，但其体外重组胚的发育差异显著。一般有两种培养条件。其一为38.5、5 %的 CO2、95%的空气；其二为38.5、5%的 CO2、5%的O2、90%的N2，研究表明在不同氧浓度下尽管囊胚形成率没有区别，但是囊胚中的细胞数在氧浓度为5%时较多。选择合适卵龄的成熟卵母细胞作为胞质受体对核移植有很大的影响。一般选择成熟培养4044h的卵母细胞。尝试选择此时间成熟的卵母细胞作为胞质受体也许能有效支持核的重新编程和重组。3.2 卵母细胞去核 卵母细胞快速而准确的去核可避免孤雌发育，缩短体外操作时间，减少实验中的干扰因素。一般有以下几种方法9， 活性荧光染料（Hoeches33342）定位法，该方法去核准确，但染料和紫外线对卵母细胞有毒害作用，所以去核时间不能过长；盲吸法，这种方法存在着技术要求高、耗费时间长、对卵母细胞损伤严重、影响细胞质空间结构等缺点；点压法，因去核时只需轻轻点击透明带，即可除去第一极连同少量细胞质，对卵母细胞质损伤较小，同时去核时不用换针，从而能有效提高去核效率；化学诱导去核法，是用脱羰秋水仙碱（Demecolcine）处理激活的MII期卵母细胞，使其排出第二极体。 由于脱羰秋水仙碱的作用，核染色质没有分开而全部进入排出的第二极体，从而完成去核；纺锤体探测技术，是利用 MII期卵母细胞的细胞质和纺缍体对光的不同折射率，在显微镜光学系统上附加在极性光学显微镜基础上研制出的一种纺缍体图像观察系统Spindleview偏振光系统，将该系统捕获的图像进行计算机处理，显示出MII期染色体所处位置，然后通过显微操作法去核，用该方法可以对MII期的卵母细胞进行准确去核。这一方法可有效用于小鼠、仓鼠、牛和人卵母细胞的去核10。 由于猪卵母细胞的脂肪滴太多，在此系统下不能长时间观察到纺锤体，但现在通过改进已有实验室应用。3.3 卵母细胞注核 注核一般分为胞质内注射和透明带下注射。 胞质内注射一般用Piezoactuation（压电陶瓷系统）微注射系统，直接把供体核注入胞质内。 透明带下注射则把整个供核细胞注射至卵周隙，并需要融合。 目前也有研究者直接把整个供核细胞注入胞质内， 不需要融合而且效果非常好，其囊胚形成率达3711。这可能是：移入的供核细胞的细胞膜会逐渐在胞质受体中消失；这样做不需要进行融合，减少了体外操作时间；移入的胞质成分也许对重构胚的进一步发育很重要；确保了 DNA 能完全进入去核的卵母细胞， 避免了获得供体核过程中对其结构的损坏，能更有效地支持重组胚的发育。 当然，Peura等12采用与传统显微操作程序相反的方法， 利用去除透明带的绵羊卵母细胞，先融合外来核，然后再去掉卵母细胞核，获得较好的结果，而且大大缩短了体外操作时间。 在显微操作方面目前已有许多科研工作者尝试着一些新的方法，这些方法主要是减少操作强度和难度，从而让更多的科研工作者更易进入这个领域。4 细胞融合 电融合是通过在短时间强电场的作用下，使细胞的双层膜产生可逆性击穿，当这种击穿发生在相邻的细胞膜接触区域时，两侧的细胞膜瞬间接触并融合。由于该方法重复性好、细胞毒性小、融合效果好，后来逐步被广大研究人员采纳，将电融合应用于胚胎细胞的融合，成为主要的融合方式。目前已有绵羊、牛、山羊、猪等动物采用电融合法获得了克隆动物13。但电融合法也受细胞间的接触面积、电场方向、融合液成分等多种因素的影响。因为融合效率的高低是动物体细胞克隆中的一个重要的环节，直接关系到克隆效率，因此，融合条件的探索和优化是克隆技术研究的重要内容之一。对融合效率有直接影响的因素包括电脉冲强度、时间、次数及交流电等。在电脉冲强度或时间不足时，不能在细胞膜上造成有效的穿孔或穿孔面积和数量不够，都不能有效地诱导融合。相反，如果电脉冲强度过大、时间过长会导致细胞膜不可逆击穿，造成细胞死亡14。另外，在施加直流脉冲前施加交流电，可以使细胞产生极化，促使细胞膜紧密接触并使接触面垂直于电极，从而提高融合效率。5 激活 在核移植过程中，因缺乏自然受精过程中的激活，需要使用物理或化学刺激，使卵母细胞激活后继续发育。Ca2+信号途径下游通路可导致卵母细胞激活，所以，创造一个短暂的Ca2+的波动是激活过程的关键，但这个过程往往难以完全复制自然受精过程中Ca2+的波动。Ozi和Hunean的研究认为15，Ca2+波动的幅度、数量、频度随对早期胚胎的分裂影响不大，但Ca2+波动与胚胎发育的效率和质量有密切关系(Ozi1et al,2001;Ducibella et al，2008;whitaker，2006)。目前主要有3种激活方案:融合前激活融合同时激活融合后激活。激活后的卵母细胞，MPF活性降低，不会使移入其中的细胞发生PCC，阻止了G2期供体染色体的再复制现象，而Gl期和S期供体核仍可继续进行正常DNA复制，因而处于Gl，S，G2期的供核细胞仍继续原来的周期进程，保持正常核型。去核并预先激活一的卵母细胞也被称为“万能受体”。体细胞核移入去核的未激活的MH期卵母细胞后，在卵胞质中高活性MPF作用下，发生核膜破裂和染色体凝集。染色质的凝集将加速核与胞质中与核重编程相关蛋白因子的交换，促进基因组重新编程的进行。核纤层蛋白被磷酸化，使得核纤层解体，进而造成了核膜发生破裂;卵母细胞质因子更易于接近染色质，从而在二者之间出现大量的蛋白质移动现象。例如:供体核上的连接组蛋白B4、核仁素以及通用转录因子TFllB等蛋白因子减少，而连接组蛋白B4、核质素、核小体ATP酶以及转录因子TFllB等结合到核上。这种染色质与胞质之间的蛋白质组分交换解除了染色质的抑制结构并抑制了供体核转录活性，从而使供核按照胞质信息开始活动。染色体凝集也会对处于不同细胞周期的供体核倍性产生影响。处于Gl/GO期的细胞，因为DNA尚未复制，其核为二倍体，当染色质凝集后仍为二倍体，重构胚可以正常发育。GZ期细胞作核供体时，由于已经完成DNA复制，染色质凝集将形成4倍体，必须使一半染色体以极体形式排出才能维持染色体的正常倍性，否则重构胚将维持异倍性而不能正常发育。而处于S期的供体核其DNA正处于复制过程中，此时发生PCC将使染色质形成“粉末状”形态，造成DNA严重损伤，重构胚不能正常发育16。 电脉冲和化学物质对能激活卵母细胞，但激活的同时不可避免地造成卵母细胞的损伤。因此，摸索出激活效率高，对卵母细胞损伤小的激活方法对胚胎的发育至关重要。注射精子提取液可能会模拟自然受精过程的Ca2+的波动，然而，目前此方法的效率较低，人们对受精过程中精子激活卵母细胞的本质仍需进一步研究。6 胚胎培养和胚胎移植 完成核移植的重组胚胎可以在体外培养一段时间，从融合胚到囊胚阶段的胚胎都可以适时移入雌性受体。选择合适的培养液和培养条件对重构胚胎的发育至关重要，为了减少体外培养环境对胚胎发育的不利影响，猪体细胞重构胚胎要尽可能早地移植入雌性体内。克隆胚胎的移植方法和胚胎移植方法相同，关键是要保证