磷酸锆固定血红蛋白的研究.doc

北京大学校长基金论文集（2003年） -磷酸锆固定血红蛋白的研究-磷酸锆固定血红蛋白的研究Immobilization of Hemoglobin on Layered -Zirconium Phosphate化学与分子工程学院00级 彭涛 PENG TAO摘要/Abstract在-磷酸锆载体上成功地固定了血红蛋白，并对固定化的血红蛋白做了初步的表征。利用正交实验设计的方法系统地考察了预撑剂正丁胺的量、pH值、离子强度以及温度等各因素对固定化血红蛋白酶活性的影响。此外，还尝试了在固定化过程中加入惰性蛋白质牛血清白蛋白以提高固定化酶的活性。In this study, we have successfully immobilized hemoglobin on layered -zirconium phosphate, and the immobilized hemoglobin was characterized. Taguchi method was used to design experiments to evaluate effects of concentration of butylamine, pH, ionic strength and temperature on immobilization behavior. We also attempted to add an inert protein, BSA, in the process of immobilization to increase the enzymatic action of the immobilized hemoglobin.关键词：-磷酸锆，固定化，血红蛋白，正交实验设计，牛血清白蛋白Key words: Layered -zirconium phosphate, Immobilization, Hemoglobin, Taguchi method, BSA1 前言酶是一种具有高效性和专一性的催化剂，但是在化学反应中直接使用游离的酶作催化剂有如下缺陷：游离酶的稳定性差容易失活；游离酶和产物不易分离，难以回收。这样酶的使用就受到了很大的局限。而固定在固体表面的酶则能够在很大程度上克服这种局限性。固定化酶有着及其重要的优点，首先它们保持了酶原有的高灵敏度和高选择性。其次固定化酶可以很容易与其产物分开，无残留，一方面使得产物易于纯化，简化了分析步骤，另一方面酶能够被回收重复利用因此也就降低了成本。更重要的是固定化可以克服酶容易失活，对有机试剂敏感等问题，从而使其稳定性大大提高。近年来对酶等生物活性大分子固定化技术的研究主要注重于两个方面究。一是对固定化方法和机理的研究，主要有吸附法，共价法，交联法以及包埋法。第二点就是有关固定化载体的研究。总的来说，固定化载体应该能够防止酶的聚合和自发性降解，同时还应该在很大程度上保持酶的活性。如今一些常见的载体有高分子材料、溶胶、受控有机玻璃、Langmuir-Blodget膜、表面活性剂膜以及水凝胶等等.有实验研究表明，当蛋白质等试剂分子被固定于纳米级结构的载体上时，与固定在普通载体上相比，其选择性和稳定性会发生惊人的变化。在各种各样的纳米材料中，有一种具有纳米级层间距的层状四价金属磷酸盐磷酸锆一直是研究和应用的热点。磷酸锆有两种不同的结构类型（图1）：-磷酸锆（-Zr(HPO4)2H2O，-ZrP）和-磷酸锆（-Zr (PO4)(H2PO4)2H2O，-ZrP）。-磷酸锆的每一层是由处于两个相互平行的平面上Zr原子，中间以PO43-和H2PO4-基团为桥梁紧密堆积而成，其中PO43-基团的四个氧原子与四个Zr原子共用，而H2PO4-基团与两个Zr原子共用2个氧原子，剩余的2个-OH基团指向层内空间。层与层之间的作用力是H2O分子和相邻两个层面上的=P(OH)2形成的氢键作用力，层间距为1.22nm，每个=P(OH)2基团周围的自由面积为0.36nm2。 图1. 两种层状磷酸锆的结构示意图，(a) -ZrP, (b) -ZrP.-磷酸锆具有一些非常特殊的性质：（1）制备是从水溶液中得到，温度要求不高，所以制备简单，同时所得产品晶形好；（2）具有热稳定性和化学稳定性；（3）表面积和表面电荷密度大，是一种较强的固体酸；（4）可以配成悬浮液，也可进一步制成纳米颗粒重新分散于溶液介质之中以用于酶的固定化。目前，-磷酸锆用于固定酶等生物活性大分子的研究报道还非常少。本论文研究的就是-磷酸锆固定血红蛋白的最佳条件选择。血红蛋白（Hemoglobin）是由Fe(II)和血红素b(作为辅基)和多肽链组成的一种结合蛋白，由四条多肽链(亚基)组成的四聚体，分子量大约为64500，等电点为pH6.9-7.3（不同的生物的血红蛋白等电点有细微差别）。血红蛋白是生物体中必备的活性物质，是生物体内很重要的O2载体。同时，它还可以作为过氧化物酶催化H2O2分解为O2的反应。2 实验方法2.1 实验药品 氧氯化锆（A.R.99.0% 北京刘李店化工厂），HF溶液（G.R.40.0% 北京化工厂），（NH4）2HPO4（A.R.99.0% 北京益利精细化学品有限公司），盐酸（A.R.37.0% 北京化工厂），磷酸（A.R.85.0% 北京化工厂），NaH2PO4（A.R.99.0% 北京化工厂），Na2HPO4（A.R.99.0% 北京化工厂），正丁胺（A.R.99.0% 北京化学试剂公司），血红蛋白（Sigma），牛血清白蛋白（Sigma），乙酸（A.R.99.5% 北京化学试剂公司），H2O2（G.R.30.0% 北京化工厂），愈疮木酚（化学纯 99.5% 北京芳草医药化工研制公司），NaH2PO4- Na2HPO4缓冲溶液（自制，I=0.05，0.1，0.2mol/L），二次水2.2 实验仪器0.1mg分析天平（E.Mettler，Switzerland）， GL-20G-型高速冷冻离心机（上海安亭），SHB-2型微型循环真空泵（郑州长城科工贸有限公司）， KQ3200E医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、雷磁PHS-3CpH计（上海精科），HZQ-F160全温振荡培养箱（哈尔滨东联电子技术开发有限公司），81-2型恒温磁力搅拌器，Rigaku Dmax 2000晶体粉末X射线衍射分析仪，UV-3010 紫外-可见分光光度计（日本HITACHI公司），VECTOR22付立叶红外光谱仪（德国Bruker公司） 2.3 -磷酸锆的合成及表征2.3.1 -磷酸锆的合成参照文献2并根据实际情况有略微改动：约7.5gZrOCl28H2O溶于7mlHF溶液内，再滴加10-20滴蒸馏水，以缓释放出的热量及防止HF过度挥发。上述溶液在搅拌下缓慢加入到640ml2mol/L(NH4)2HPO4溶液中。所得溶液分装，80。C下水浴48小时。离心分离，沉淀与0.5mol/L (NH4)2HPO4溶液在80。C水浴下反应3次，每次3小时。离心分离沉淀，沉淀先后用1mol/L HCl溶液和0.5mol/LH3PO4溶液各洗涤三次，最后用二次水洗涤，抽滤干燥即得所需样品。将其研细待用。2.3.2 -磷酸锆的表征 所用仪器为Rigaku Dmax 2000晶体粉末X射线衍射分析仪。取少量合成的白色产品粉末，做XRD粉末多晶衍射，得到的图谱如下所示：图2. -磷酸锆的XRD图谱从图中可以看到，最大峰位约在2q=7.70。处，可以算得晶体的最大层间距为1.15nm，这与文献值1.22nm较为接近。此外，从图中可以看到，在2q=7.70。处的峰强度非常大并且非常尖锐，这说明合成样品所含杂质很少，纯度非常高。因此可以认为，此次合成的产品就是型的磷酸锆。2.4 -磷酸锆的预撑与悬浊液的制备将- ZrP分散到一定离子强度的磷酸系缓冲溶液中，加入适量的预撑剂正丁胺（为简化起见，下文以BA表示正丁胺），用3mol/L NaOH或H3PO4溶液调节pH到一定值，超声处理（120W）20min即得-磷酸锆的悬浊液。(为了简化起见，下文用M.R.=1:5表示正丁胺的浓度，其中数字部分为载体与正丁胺的摩尔比；使用BA-ZrP表示经正丁胺预撑处理过的-ZrP。)2.5 血红蛋白的固定化a.称取0.1614g血红蛋白溶于一定离子强度的磷酸系缓冲溶液中，并定容与250ml容量瓶内，配成10mol/L浓度的溶液；b.在已经过预撑处理的-磷酸锆悬浊液内加入适量血红蛋白溶液，并用3mol/L NaOH或H3PO4溶液调节上述溶液pH到一定值，在一定温度下用恒温振荡器振荡8小时；c.离心分离所得溶液，收集固定化酶，用紫外-可见分光光度计测量上清液中血红蛋白在Soret区的特征紫外吸收，计算上清液中血红蛋白的含量；d.用缓冲溶液洗涤固定化酶，直至检测不到有血红蛋白的特征吸收；e.冷冻干燥固定化酶。2.6 固定化血红蛋白催化活性的分析以邻甲氧基苯酚为底物来测定固定化血红蛋白的酶活。邻甲氧基苯酚（愈疮木酚）在血红蛋白的催化下与过氧化氢发生如下的反应：有色产物四邻甲氧基连酚e470nm=(26.6mmol/L)-1cm-1在470nm处有光谱吸收，可以通过测定此处的吸光度变化来计算此酶促反应的反应速率。实验中采用终止法测定固定化酶的催化活性。准确称取固定化酶，分散到缓冲溶液后加入一定量的愈疮木酚，于37。C恒温10分钟。加入100l 2%的H2O2开始催化反应，振荡反应一定时间之后，加入1ml 40%的乙酸溶液终止反应。离心分离沉淀，测定上清液在470nm处的吸光度。按下式评价所制备的固定化酶的生物催化活性：固定化酶的活性=A470nm / t w 其中，t为酶促反应时间（min），w为被测固定化酶的用量（g）。2.7 X射线衍射分析使用Rigaku Dmax 2000晶体粉末X射线衍射分析仪来摄取各种纳米复合物的X射线衍射图谱。使用Cu靶，k射线以及Ni单色器，管电压为40 kV，管电流为80 mA，扫描速度分别为1/min(0.6-3) 和8min(3-40)。3 实验结果与讨论3.1 -磷酸锆预撑条件的选择实验中采用正丁胺作为-磷酸锆的预撑剂，但是预撑条件的不同对预撑效果有着及其重要的影响。3.1.1 pH值对预撑效果的影响我们在四个不同的pH值下对-磷酸锆用正丁胺进行了预撑（M.R.=1：5），四个pH值分别为：12.0，6.9，6.8，6.7。分离得到的BA- ZrP复合物作XRD衍射分析，结果如下图所示： 图3. 不同pH条件下正丁胺预撑的-磷酸锆的XRD图谱（3。-40。） （a）pH=6.8 （b）pH=6.7 （c）pH=6.9 （d）pH=12.0从上图可以看出，当pH=12.0的时候，X衍射图谱上并没有出现新的衍射峰，这说明正丁胺并没有进入-磷酸锆的层间。此外，-磷酸锆原有的衍射峰遭到了极大的破坏，峰形不再尖锐，出现了很多肩峰。在pH=6.9，6.8和6.7的时候，在X衍射图谱上都可以看见在小角方向上出现了新的衍射峰，主体在2=7.70。的特征衍射峰向小角度2=4.16。发生了移动，但其它的衍射峰并没有发生很大的变化，这说明晶体仍然保持原有的结构和有序度，只是层间距由原来的2d=1.15nm增大到2.12nm。同时可以发现，pH=6.8，6.7的时候-磷酸锆原来的特征衍射峰强度比新的衍射峰要大，而pH=6.9的时候新的衍射峰强度超过了原来的衍射峰。这说明在进行-磷酸锆预撑的时候pH值是至关重要的。预撑的可能机理为：正丁胺的氨基与载体的P-OH基团发生反应从而嵌入到-磷酸锆的层间。pH值的大小影响到了正丁胺分子与-磷酸锆所带的电荷，也就影响到了正丁胺的氨基与载体的P-OH基团发生的反应。这样就解释了为什么pH=6.9时的新衍射峰强度与pH=6.8，6.7时的情况有差别的原因。以后实验中在对-磷酸锆用正丁胺进行预撑时都调节pH到6.9。此外，从上述图谱中还可以看出，即便是pH=6.9的时候，-磷酸锆载体的原有特征衍射峰强度仍然较大（Intensity在1700左右），这说明在正丁胺嵌入时已被撑层的载体和未被撑层的是两相共存的。我们可以找到两个原因来解释这一问题。一是离子强度。上面提到，用正丁胺预撑的可能机理为：正丁胺的氨基与载体的P-OH基团反应而嵌入到-磷酸锆的层间。随着正丁胺的嵌入，层与层之间原有的氢键和范德华力被破坏，但没有发生层板剥离，这是因为正丁胺的碳链之间存在相互吸引的憎水作用力，所以随着正丁胺的嵌入-磷酸锆仍然保持层状结构，只是使层间距离扩大。在高离子强度下，由于其它离子的屏蔽，影响了正丁胺的碳链间的相互吸引作用，也就是干扰了正丁胺的顺利嵌入，所以已被撑层的-磷酸锆载体和未被撑层的两相共存。二是正丁胺的用量。有可能是预撑时正丁胺的量较少所导致的。3.1.2 正丁胺的用量对预撑效果的影响在pH=6.9，M.R.=1：5的条件下，我们发现正丁胺已经成功的嵌入到了-磷酸锆的层间，但是我们同时发现载体旧衍射峰的强度依然比较大。因此我们加大了正丁胺的量以考察其对预撑效果的影响。得到的结果如下图所示： 图4. 不同正丁胺的用量下预撑所得的XRD图谱（3。-40。） （a）M.R.=1：5 （b）M.R.=1：10 （c）M.R.=1：15从这个图可以看出，随着正丁胺量的增加，新衍射峰的强度相对于旧衍射峰有了明显的增大。这说明绝大部分的-磷酸锆载体都已经被正丁胺成功撑层。3.2 固定化血红蛋白的表征3.2.1 红外光谱分析-磷酸锆、血红蛋白、BA- ZrP以及血红蛋白-磷酸锆复合物的红外光谱图如下： 图5. -磷酸锆的红外光谱图 图6. 血红蛋白的红外光谱图图7. BA- 磷酸锆的红外光谱图 图8. 血红蛋白-磷酸锆复合物的红外光谱图对比上图5和图7可以看出，-磷酸锆载体经正丁胺预撑处理后，-磷酸锆的酸性磷酸集团在1229.3cm-1的吸收峰消失，证明正丁胺与载体酸性位点发生了中和反应。同时我们可以在BA- ZrP的红外图谱图7中看到，在2900 cm-1附近新产生了2-3个吸收峰，这是烷基的C-H伸缩振动特征吸收带，此外在1475 cm-1附近还有烷基的特强变形振动吸收带。这些进一步证明了正丁胺确实已进入-磷酸锆的层间。-磷酸锆载体在固定血红蛋白分子之后，可以从图8中明显观察到蛋白质在1650 cm-1处的特征酰胺带吸收和在1550cm-1处的特征酰胺吸收，这就说明-磷酸锆载体层间确实固定上了血红蛋白分子，也同时说明-磷酸锆在固定血红蛋白后，并没有引起蛋白质结构发生很大变化。其中酰胺带相对于游离态的血红蛋白向低波数略有偏移，说明血红蛋白分子的二级有序结构被轻微干扰。此外在图8中还可以看到在2900 cm-1附近的烷基C-H伸缩振动特征吸收带和在1475 cm-1附近烷基的变形振动吸收带，这说明-磷酸锆在固定血红蛋白后正丁胺分子仍存在层间。3.2.2 X射线衍射分析从大角衍射图谱图10上可以看到，由于正丁胺嵌入而产生的新特征峰强度相对于BA- ZrP图谱中的新特征峰强度已大幅减小，说明-磷酸锆载体的层间距又发生了变化，可能是血红蛋白分子已嵌入到了BA- ZrP的层间。在小角度衍射图谱（图9）上，在2q=0.68。处出现了新的衍射峰。这说明血红蛋白分子已成功进入-磷酸锆载体的层间。（a）Hb-BA- ZrP （b）BA- ZrP图9. BA- ZrP和Hb-BA- ZrP的XRD图谱（0.6。-3。）图10. BA- ZrP和Hb-BA- ZrP的XRD图谱（3。-40。）3.3 -磷酸锆固定血红蛋白的条件选择血红蛋白分子嵌入-磷酸锆层间的主要作用力是血红蛋白分子与载体层内基团之间的静电吸引力。因此任何影响血红蛋白和载体所带电荷的因素都会影响到固定化的效果，我们引入了正丁胺的用量、pH值、离子强度I和温度t来考察它们对固定化作用的影响。为了节省实验次数并对-磷酸锆固定血红蛋白的条件变化作出预测，实验中采用了正交实验设计的方法以寻找固定化的最佳条件。以上清液中血红蛋白的特征紫外吸光度A405和固定化酶活作为固定化条件的评定依据。实验计划、结果记录及分析计算表如下所示：表1. -磷酸锆固定血红蛋白条件实验的正交设计及结果分析表 实验设计 实验结果 因素实验组BA的用量（M.R.）pH值离子强度I（mol/L）温度t（）吸光度 A405酶活A470/ming 1（1：15）（5.9）（0.1）（15）0.5950.1192（1：10）（6.9）（0.2）（15）0.8700.3923（1：5）（4.9）（0.05）（15）0a0.6224（1：15）（6.9）（0.05）（25）0.6250.5175（1：10）（4.9）（0.1）（25）00.6246（1：5）（5.9）（0.2）（25）0.5460.436 7（1：15）（4.9）（0.2）（35）00.577 8（1：10）（5.9）（0.05）（35）0.0170.4529（1：5）（6.9）（0.1）（35）0.1000.418以A405评定K11.22000.6421.465九次实验指标之总和=2.753K20.8871.1580.6951.171K30.6461.5951.4160.117极差0.5741.5950.7741.348以酶活评定K11.2121.8231.5901.132九次实验指标之总和=4.156K21.4671.0061.1611.577K31.4761.3271.4041.447极差0.2640.8170.4290.444注：a. A405=0表示405nm处无血红蛋白特征吸收峰b.各因素内圈内数字表示因素内各水平的编号c. K1表示水平1三次指标之和，依次类推d极差即指标随因素水平变化而变化的最大范围3.3.1 实验结果分析a.从上表得到，固定化较好的条件为第三组和第五组实验。其中第五组的实验条件为：正丁胺M.R.=1：10，pH=4.9，离子强度I=0.1mol/L，温度t=25。b.从极差情况来看，不管是以A405还是以酶活作为评定的依据，pH值都是影响固定化优劣的决定性因素。其次，以酶活为评定依据时离子强度I和温度t也是影响固定化优劣的重要因素，正丁胺的量相对来说不很重要。当以A405作为评定依据时，离子强度I和正丁胺的量比温度t在固定化中起着更重要的作用。c.以酶活为评定依据，画出各因素水平与实验结果之和的关系图如下所示：图11.1 酶活与M.R.关系变化趋势图 图11.2 酶活与pH关系变化趋势图 图11.3 酶活与离子强度关系变化趋势图 图11.4 酶活与温度关系变化趋势图 图11. 各因素水平与实验结果之和的关系图从上图11可以做出预测，可能比第五组实验结果更好的条件组合为：正丁胺M.R.=1：5，pH=4.9，离子强度I=0.05mol/L，温度t=25。实验结果确实如此，在预测的条件下实验测得酶活=0.629 /ming。至此，得到了固定化血红蛋白的最优条件：正丁胺M.R.=1：5，pH=4.9，离子强度I=0.05mol/L，温度t=25。3.3.2 正丁胺的用量对血红蛋白固定化的影响图12. 上清液吸光度值A405与M.R.关系变化趋势图随着BA浓度增大，固定血红蛋白后的上清液血红蛋白紫外特征吸光度值A405逐渐变大（图12），说明血红蛋白在-磷酸锆上的装载量不断减少。这是因为随着正丁胺量的增多，在预撑时正丁胺分子会占据绝大部分的层内位点，并且通过其链间的疏水作用而紧密结合在一起，这样在固定血红蛋白的时候大量的正丁胺分子就阻止了血红蛋白分子进入载体的层间。因此上清液A405值随着正丁胺量的增多而增大。同时，固定化酶的活性也随着正丁胺量的减小而增大（图11.1），这是因为：血红蛋白的装载量随着正丁胺量的减小而增大。层间正丁胺浓度较低有利于底物分子接近血红蛋白的活性中心，从而增大其催化活性。3.3.3 pH值对血红蛋白固定化的影响血红蛋白分子表面所带静电荷会随着pH值偏离pI值而增多。如果血红蛋白的固定存在有静电作用力，那么其分子与载体的作用力也会增强。实验表明（图13），随着pH值的降低（），固定血红蛋白后的上清液中血红蛋白的浓度不断降低，说明了装载量的增多，又一次证明血红蛋白的装载确实存在有静电作用力。此外，从实验中洗涤情况来看，pH值越低，血红蛋白与载体的结合越紧密。当pH=6.9的时候固定化血红蛋白需要洗涤6、7次才能洗干净，而pH=4.9的时候基本上不需要洗涤。如果pH越低于pI，所带正电荷越多，和持有负电荷的载体作用就会越强，但是，血红蛋白却会因为pH的降低而有损失其生物活性的危险。这也许就是pH=5.9时的酶活要低于pH=6.9时酶活的原因（图11.2），虽然前者的载体装载量要大于后者。至于BA-ZrP在pH=4.9条件下固定血红蛋白的活性高于其它pH条件（图11.2），可能是因为在pH=4.9时嵌入层间的血红蛋白远大于其它两个pH条件（图13），因此大部分的血红蛋白分子并未受到极端pH值的影响，所以活性损失少。 图13. 上清液吸光度值A405与pH关系变化趋势图3.3.4 离子强度I对血红蛋白固定化的影响 图14. 上清液吸光度值A405与离子强度关系变化趋势图实验结果表明（图14），在低离子强度下血红蛋白的装载量相对较高，而在高离子强度在血红蛋白的装载量较低。这进一步表明静电作用力是血红蛋白固定化过程中的主要作用力之一。当离子强度比较大的时候，由于其它离子的屏蔽，影响了正丁胺的碳链间的相互吸引作用，也就是会干扰正丁胺的顺利嵌入，所以高离子强度下正丁胺的嵌入量比较少，进而也就会影响到血红蛋白分子的嵌入。由于低离子强度下固定化的血红蛋白量比较多，并且低离子强度有利于底物分子接近酶活性中心，所以较低的离子强度下酶活较高。3.3.5 温度对血红蛋白固定化的影响图15. 上清液吸光度值A405与温度关系变化趋势图随着温度的升高，血红蛋白的装载量也逐渐增大（图15）。这是因为较高的温度加大了分子的运动激烈程度，因而有利于血红蛋白分子进入-磷酸锆载体的层间。但是酶活随着温度的变化关系却不是那么简单，见图11.4。虽然35时血红蛋白的装载量最大，但是酶活的最大值却出现在25。这是因为虽然高温有利于血红蛋白分子进入层间，但是长时间地处于高温下很有可能会损失血红蛋白的活性。3.4 加入牛血清白蛋白（BSA）对提高固定化酶活性的尝试实验中还对提高固定化酶活性进行了尝试。牛血清白蛋白（BSA）作为一种惰性蛋白质在固定血红蛋白之前先被固定，它可以占据固定的位点，以方便调节血红蛋白分子的排布，并能减小载体中重金属锆对血红蛋白分子的不利影响。同时由于BSA对血红蛋白的底物不具有催化活性，不会对测定酶活的结果造成影响。3.4.1 实验方法见2.5血红蛋白的固定化部分。在加入血红蛋白溶液之前先加入牛血清白蛋白溶液，振荡8小时，再加入血红蛋白溶液进行固定化。所有条件均为上述所得的最佳固定化条件。3.4.2 不同BSA的浓度对固定化效果的影响在实验中，改变加入的BSA的量，考察BSA浓度的改变对固定化酶活性的影响。表2. BSA的浓度对固定化效果的影响BSA浓度（mg/ml） 0.010.02上清液吸光度A40500000酶活A470/ming0.709 0.765 0.8040.817 0.782图16. 固定化酶活与BSA浓度关系的变化趋势图从上图可以看出，BSA浓度在0.25mg/ml时，固定化酶的活性最大。4 结论在实验中，我们成功地利用-磷酸锆固定了血红蛋白，并对固定化酶进行了X射线衍射分析和红外分析。同时，在实验中还利用正交实验设计的方法系统地考察了诸多实验条件比如预撑剂的用量、pH值、离子强度和温度等对固定化血红蛋白酶活性的影响，找到了-磷酸锆固定血红蛋白的比较好的实验条件，还为进一步提高酶活性进行了尝试，这为以后工作的进一步展开奠定了基础。-磷酸锆固定血红蛋白的最佳条件为：正丁胺M.R.=1：5，pH=4.9，离子强度I=0.05mol/L，温度t=25，加入适量的BSA对提高酶活性有重要作用。5 致谢首先要感谢校长基金委员会给我一个这么好的进行科研的机会。没有校长基金的鞭策和资助，很难想象我会这么早就接触科研并且顺利地完成了研究课题。不夸张地说，是校长基金督促并帮助我走出了人生中最重要的一步。 感谢我的指导老师李娜老师。李老师学识渊博，待人诚恳，在这将近一年的时间里，李老师的言行举止都给我留下了深刻的印象。在李老师的言传身教下，我懂得了什么叫做科研，什么是一个科研工作者必须具备的基本素质，知道了勤奋严谨的科学态度，知道了在科研中始终应该乐观地面对困难，也知道了在生活中应该时刻注意保持激情。这些对我以后的人生道路都有着重要的指导意义。同时，我还要衷心感谢本课题组关心和帮助过我的老师们，他们是：李克安老师，赵凤林老师，刘锋老师以及杨荣华老师。还有S319X射线衍射分析室的廖复辉老师和中级仪器实验室的潘伟老师，谢谢你们为我提供的仪器和指导。 我还要感谢同实验室的耿利娜师姐、张莉师姐、王海燕师姐、李社红师姐、徐达师兄和相明辉师兄，感谢你们的包容和帮助。最后，感谢所有关心和帮助我的人，谢谢你们！6 参考文献：1. Challa V. 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