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第三章 血栓与止血一般检验 实验一 血小板计数【目的】 掌握血小板(platelet)的显微镜目视计数方法。【原理】 血液经稀释液按一定比例稀释和破坏红细胞后，滴入血细胞计数板内，在显微镜下计数一定范围内的血小板数量，经过换算求出每升血液中血小板的数量。【器材】 1试管、试管架。2吸管、吸耳球。3微量吸管、胶吸头、干脱脂棉。4玻棒。5改良Neubauer计数板、盖玻片、绸布。【试剂】 10g/L草酸铵稀释液：草酸铵10g，EDTA-Na 2 0.12g溶于1000ml蒸馏水中，混匀。【标本】 EDTA-K2抗凝静脉血或末梢血。【操作】1吸取稀释液 准确吸取10g/L草酸铵稀释液0.38ml，置于清洁小试管中。2采血及加血 常规消毒无名指，穿刺后，让血液自然流出，准确采血20L，置于含有草酸铵的稀释液中，立即充分混匀。3稀释 待完全溶血后再混匀1min。4充液静置 取混匀的血小板悬液1滴充入计数池内，静置1015min，使血小板充分下沉。空气干燥季节应将血细胞计数板置湿盒内。5计数 用高倍镜计数中央大方格的四角和中央共5个中方格内血小板数量。6计算 血小板数/LN51020106=N109N： 表示5个中方格内数得的血小板数。 5： 将5个中方格血小板数换算成1个大方格血小板数。 10： 将1个大方格血小板数换算成1l血液内血小板数。20： 血液的稀释倍数。106： 由1l换算成1L。7报告方式 XX109/L。8操作示意见图2-1。【参考值】 （100300）109/L。【注意事项】 1稀释液的要求 定期检查稀释液的质量，检测前应先作稀释液空白计数，计数值为零时方可充液计数。草酸铵稀释液要清洁，无细菌、尘埃等污染。存放时间较长后应过滤后再使用。2采血 毛细血管采血时，针刺应达3mm深，使血液流畅。拭去第1滴血后立即采血，以防血小板聚集和破坏。如果同时做白细胞和血小板计数时，应先采血做血小板计数。3制备悬液 血液加入血小板稀释液内要充分混匀，必须轻轻摇动标本2min或200次以上，但不可过度振荡，以免导致血小板破坏、聚集或有气泡，引起计数误差。4充池 血小板悬液充入计数池内需要静置1015min，使血小板完全下沉后再计数。但应注意保持湿度，避免水分蒸发而影响计数结果。血小板如成簇分布，应重新采血复查。溶血欠佳时，应更换稀释液或用200倍稀释法计数整个中间大方格内的全部血小板数，最后计算出每升血液中的血小板数量。5计数的光线要求 计数时光线不可太强，注意微有折光性的血小板与尘埃等的鉴别，附着在血细胞旁的血小板也要注意，不要漏数。6计数 如果血小板悬液充入计数池后时间较长，血小板会失去光泽而不易辨认，因此应掌握好计数时间，应在1h内计数完毕，否则结果偏低。每份标本最好计数2次，若计数之差在10%以内，取其均值报告。若计数之差大于10%，应作第3次计数，取2次相近结果的均值报告。7器材与试剂 所用计量器材必须标准化。草酸铵质量必须是AR级或GR级，若用CP级溶血效果差。8药物影响 检查前患者应避免服用含有阿司匹林及其他抗血小板药物。 （刘成玉）实验二 凝血酶原时间测定一、试管法【目的】 掌握凝血酶原时间 (prothrombin time, PT ) 测定的试管法。【原理】 PT 是在体外满足外源性凝血全部条件后的血浆凝固所需的时间。在抗凝血浆中加入过量的组织凝血活酶和Ca2+，使凝血酶原转化为凝血酶，后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。测定从加入Ca2+ 到血浆开始凝固所需时间，即为PT。【器材】 1. 1. 水浴箱。2. 2. 试管、试管架。3. 3. 吸样枪、吸头。4. 4. 离心机。5. 5. 秒表。【试剂】125 mmol/L氯化钙凝血活酶试剂(商品试剂) 按说明书要求加一定量蒸馏水溶解、混匀后使用，试剂必须注明国际敏感指数(international sensitivity index，ISI)。2正常参比血浆（商品试剂） 用20个以上男女各半正常人血液经109 mmol/L枸橼酸钠抗凝(血液与抗凝剂之比为9：1)。以3000r/min离心10 min ，分离血浆后，混合分装为每瓶1 ml ，冻干保存。【标本】 109 mmol/L枸橼酸钠抗凝的静脉血(血液与抗凝剂之比为9：1)。【操作】1分离乏血小板血浆 将标本以3 000r/min离心10min，分离血浆。2平衡温度 将冻干保存的正常参比血浆和氯化钙组织凝血活酶溶液置室温中15 min。3温浴 将正常参比血浆、待检血浆和氯化钙凝血活酶溶液置37水浴中温浴5 min。4测定正常参比血浆的PT(1) (1) 启动计时：取小试管1支，加入正常人参比血浆0.1 ml，37水浴预温30 s，再加入经预温的氯化钙组织凝血活酶溶液0.2 ml ，立即混匀并启动秒表。(2) (2) 终止计时：不断轻轻倾斜试管，记录至液体停止流动所需要的时间。(3) (3) 重复步骤（1）、（2）测定23次，取平均值，即为PT值。5测定待检血浆的PT 取待检的乏血小板血浆参照步骤4的操作方法测定其PT值。6报告方式 以直接测定的时间（PT）报告，同时，报告正常参比血浆PT。以PT比值( prothrombin ratio，PTR) 报告：PTR=待检血浆PT/正常参比血浆PT。以国际标准化比值 (international normalized ratio, INR) 报告：INR=PTR ISI。7操作示意见图3-1。图3-1 凝血酶原时间测定操作示意图【参考值】 每个实验室应建立所用测定方法相应的参考值。通常：PT：成人1113s，新生儿延长23s，早产儿延长35s（34d后达到成人水平）；待检者的测定值较正常对照值延长超过3 s以上有临床意义。PTR：0.851.15。INR： 0.851.5；口服抗凝剂治疗不同的疾病需不同的INR，临床常将INR 24作为口服抗凝剂治疗的适用范围。【注意事项】1试剂 由于不同来源、不同制备方法的组织凝血活酶对结果影响很大，造成结果的可比性差，特别影响判断口服抗凝剂的治疗效果。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)提出以人脑凝血活酶67/40批号作为标准品，并以ISI表示各种制剂与67/40之间的相互关系。67/40为原始参考品，定67/40的ISI为1.0。市场上供应的组织凝血活酶试剂应注明ISI值，选用ISI2.0的组织凝血活酶为宜。2标本 (1) (1) 应使用对凝血因子无激活作用的塑料制品或硅化的玻璃器械收集标本，如硅化试管、硅化注射器等。所用试管必须洁净、干燥、无划痕。(2) (2) 采血要顺利，否则可激活凝血因子。静脉压迫时间过长可引起局部纤溶活化。(3) (3) 采血后应仔细检查标本有无溶血、黄疸、脂血和血凝块，任何微小的凝块都会影响测定结果，必须重新采血。溶血的血浆可导致凝血时间假性缩短。部分凝血可导致凝血时间假性延长。(4) (4) 血液与抗凝剂要充分混匀。血液与抗凝剂比例 ( 9 : 1 ) 要准确。枸椽酸盐比例过高或过低，都会影响PT测定结果的准确性。(5) (5) 采血后宜在1h内完成测定。血浆在4保存不应超过4h ，-20可保存14d ，-70可保存6个月。(6) (6) 血细胞比容（Hct）小于0.2或大于0.5时，应按下式调整抗凝剂的用量：抗凝剂( m1 ) =（100Hct）血液 ( m1 )0.00185。(7) (7) 由于每次使用的氯化钙凝血活酶活性不尽相同，测定的条件也略有变动，故每次测定均需有正常对照。(8) 分离血浆时离心条件要确保。以3 000 r/min 离心10 min，以获得乏血小板的血浆；如果血浆中富含血小板，可导致凝血时间假性缩短。3温浴 水浴温度要控制在 ( 37.00.5 ) ，温度过高或过低都可影响测定结果。温度过高，凝血时间缩短；温度过低，凝血时间延长。4测定 (1) (1) 检测方法要规范化，尽量采用国际血栓和止血委员会（International Committee on Thrombosis and Haemostasis，ICTH） 及国际血液学标准化委员会（ International Council for Standardization in Haematology，ICSH ）公布的参考方法。(2) (2) 先测定正常参比血浆的凝血酶原时间，结果在正常允许范围内才测定待检者血浆。 (3) (3) 所有标本均做23次测定，结果相差应小于5。若2个结果相差大于5，再做1次单份或双份测定，取相近2个结果的均值报告。5报告方式 目前PT报告方式有PT、PTR和INR。前两者存在的偏差较大，对临床上指导口服抗凝药物冶疗用量有一定危险性，且难以开展室间质量评价。因此在报告PT、PTR的同时，为了标准此类待检者凝血功能的表述，应按ICTH及ICSH的建议报告INR。影响INR的因素较多，主要有：ISI：ISI值越大，试剂的敏感性就越低，PTR换算成INR值的误差也就越大；试剂对凝血因子缺乏的反应性的差异；不同凝血活酶测得PTR的精确性不同。二、血凝仪法【目的】掌握凝血酶原时间的血凝仪测定法。【原理】同试管法。【器材】1血凝仪。2其余同试管法。【试剂】同试管法。【标本】同试管法。【操作】1分离乏血小板血浆 同试管法。2平衡温度 同试管法。3预温 同试管法。4测定正常参比血浆的PT 按血凝仪的操作方法将正常人参比血浆0.1ml，与氯化钙组织凝血活酶试剂0.2ml混匀，血凝仪自动测定血浆凝固的终点，并显示正常人混合血浆的PT值。5测定待测血浆 以同样方法测定待测血浆的凝固时间。6报告方式同试管法。【参考值】同试管法。【注意事项】1规范操作 为了确保试验的准确性，必须应用仪器配套供应的试剂，并且严格按照操作规程操作。2血凝仪（1）PT的仪器法测定由半自动或全自动血凝仪完成，全自动血凝仪的准确性和精密度高。不同仪器及试剂测定同一血浆，其PT也有一定差异，但INR应一致。（2）血凝仪的检测原理也不尽相同。常用的有比浊法、黏度法。比浊法是通过血浆凝固前后光散射的变化来检测血浆的凝固时间。脂血、黄疸、溶血等标本影响测定，但黏度法克服了这一缺点。黏度法是通过感受检测体系内磁珠的振幅变化来检测试验终点。3其他同试管法。 实验三 活化部分凝血活酶时间测定一、试管法【目的】掌握活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time, APTT) 测定的试管法。【原理】 APPT 是在体外满足内源性凝血全部条件后的血浆凝固所需的时间。在37条件下，以白陶土（激活剂）激活因子，以脑磷脂（部分凝血活酶）代替血小板提供凝血的催化表面，再加入适量的Ca2+ 即可满足内源性凝血的全部条件。测定从加入Ca2+ 到血浆凝固所需的时间即为APTT。【器材】 同凝血酶原时间测定。 【试剂】1APTT试剂 含激活剂白陶土、硅藻土或鞣花酸及部分凝血活酶脑磷脂，液体试剂混匀后可直接使用，冻干试剂需用蒸馏水溶解再使用。225 mmol/L氯化钙溶液 无水氯化钙2.7747 g溶于1000 ml蒸馏水。3正常参比血浆（商品试剂）。【标本】 同凝血酶原时间测定。【操作】1 1 分离乏血小板血浆 同血浆凝血酶原时间测定。2 2 平衡温度 用蒸馏水溶解正常人参比血浆，于室温下静置15 min以上，充分混匀。3温浴氯化钙溶液 将25 mmol/L氯化钙溶液于37水浴中温浴3 min 。4测定正常人参比血浆的APTT(1) (1) 温浴活化：试管中加入正常人参比血浆和APTT试剂各0.1 ml，混匀，37水浴中温浴3 min，期间轻轻振摇数次。(2) (2) 加Ca2+ 计时：试管中加入温浴至37 的25 mmol/L氯化钙溶液0.1ml ，立即混匀并开始计时，并置水浴中不断振摇。约30 s时，不时地缓慢倾斜试管，观察试管内液体的流动状态，当液体停止流动时停止计时，记录时间(秒)。(3) (3) 重复步骤（1）、（2）测定23次，取其平均值。5测定待检血浆的APTT 取待检血浆参照步骤4的操作方法测定其APTT值。6报告方式 待检血浆 APTT： XX s;正常人参比血浆 APTT： XX s。7操作示意见图3-2。图3-2 活化部分凝血活酶时间测定操作示意图【参考值】每个实验室应建立所用测定方法相应的参考值。通常：25.0735.00s（超过正常对照10s以上有临床意义）。 【注意事项】1试剂 试剂质量对APTT测定结果影响很大，不同的部分凝血活酶试剂,其质量也不同。一般选用对因子、在血浆浓度为200250 U / L时灵敏的试剂。激活剂因规格不一，其致活能力不同，因此参比值有差异。如果正常人参比血浆APTT明显延长，则提示APTT试剂质量不佳。2标本 采血后应尽快检测，最迟不应超过2 h 。被检血浆放置过久，凝固时间有缩短的倾向。3 3 测定 血浆加APTT试剂后的温浴时间不得少于3 min 。时间过短，APTT延长。4其它同血浆凝血酶原时间测定。二、血凝仪法【目的】 掌握活化部分凝血活酶时间（APTT）的血凝仪测定法。【原理】同试管法。【器材】1血凝仪。2其余同试管法。【试剂】同试管法。【标本】同试管法。【操作】1分离乏血小板血浆 同试管法。2平衡温度 同试管法。3温浴氯化钙溶液 同试管法。4 4 测定正常人参比血浆的APTT。(1) 温浴活化：同试管法。(2) 在试管中加入25mmol/L氯化钙溶液0.1ml，血凝仪自动测定混合物凝固的终点，并显示出正常人参比血浆APTT结果。5测定待测血浆 以同样方法检测待检血浆的APTT。6报告方式 同试管法。【参考值】同试管法。【注意事项】同试管法。实验四 纤维蛋白原含量凝血酶法测定【目的】 掌握纤维蛋白原（fibrinogen, Fg ）含量测定的凝血酶法( Clauss method)。【原理】 纤维蛋白原与凝血酶作用形成不溶性纤维蛋白，因而血浆在加入凝血酶后即逐渐凝固，凝固时间与血浆中纤维蛋白原的浓度呈负相关。以国际标准品为参比血浆制作“凝固时间（s） 纤维蛋白原浓度（g/L） ”标准曲线。测定被检血浆的凝固时间，被检血浆的纤维蛋白原含量即可从标准曲线上查得。【器材】 同凝血酶原时间测定。【试剂】1纤维蛋白原参比血浆（冻干品）。2凝血酶(冻干品)。3. 巴比妥血浆稀释液(barbital- buffered saline，BBS)：取巴比妥钠5.875 g ，氯化钠7.335 g ，溶于750 ml蒸馏水中，加入0.l mol/L盐酸215 ml ，调节pH至7.35 ，加蒸馏水至1000 ml 。【标本】同凝血酶原时间测定。【操作】1分离乏血小板血浆 同凝血酶原时间测定。2制备标准曲线(1) (1) 复溶：取蒸馏水准确复溶纤维蛋白原参比血浆；取蒸馏水2 ml复溶凝血酶。(2) (2) 稀释参比血浆： 用BBS将复溶的参比血浆分别按15 ，110 ，115 ，l20 ，140稀释，计算出各稀释倍数的纤维蛋白原浓度（g/L）。(3) (3) 温浴参比血浆：取不同浓度的参比血浆0.2 ml于试管中，置37水浴中温浴2 min 。(4) (4) 加凝血酶溶液计时：取已复溶的凝血酶溶液0.1 ml加入上述参比血浆中，立即开启秒表，观察并记录凝固时间（秒）。(5) (5) 复检：每一浓度的参比血浆以同样方法重复检测1次，取其平均值作为凝固时间；若2次结果相差大于0.5s，则需要再重复1次，取2次结果的均值。(6) (6) 绘制标准曲线：以各稀释倍数的纤维蛋白原浓度（g/L）为横坐标，对应的凝固时间 ( s ) 为纵坐标，在双对数坐标纸上绘出标准曲线。3检测待检血浆(1) (1) 稀释待检血浆：将待检血浆用BBS做10倍稀释。(2) (2) 温浴待检血浆：取已稀释的待检血浆0.2 ml于试管中，置37水浴中温浴2 min。(3) (3) 记录凝固时间：取已复溶的凝血酶溶液0.1 ml加入待检血浆中，立即开启秒表，观察并记录凝固时间（秒）。(4) (4) 复检：以同样方法重复检测1次，取其平均值作为凝固时间；若2次结果相差大于0.5 s，则需要再重复1次，取2次结果的均值；如遇有凝固时间长的标本，使2次结果相差很大，可用1:5的稀释血浆进行检测，将检测结果除以2再报告。(5)读、计Fg浓度：根据步骤（4）计得的凝固时间查标准曲线，可得待检血浆的纤维蛋白原浓度。5 5 报告方式 XX g/L。6 6 操作示意见图3-3。图3-3 纤维蛋白原含量测定操作示意图【参考值】 成人：24g/L。新生儿：1.253.00g/L。【注意事项】 1试剂凝血酶法对参考品的要求高，故必须保证参比血浆（冻干品）的质量。2复溶 凝血酶复溶后，置于46环境中可保存2天。3稀释参比血浆 (1) 稀释倍数必须准确。(2) 浓度高于4.0 g / L的血浆或低于0.8 g / L的血浆必须按适当比例进行稀释，并重新测定。(3) 血浆稀释至纤维蛋白原浓度为0.10.5g / L 。在此浓度范围内，纤维蛋白原的浓度与血浆凝固时间有相关性。4制备标准曲线每换一批号凝血酶，都应重新制备标准曲线。5报告结果纤维蛋白原浓度降低常见于： 血浆纤维蛋白原浓度真正降低；血浆纤维蛋白原浓度假性降低，即由于血浆中出现肝素、纤维蛋白原降解产物或罕见的异常纤维蛋白原血症所致。出现以上情况时应进一步用其它方法如ELISA或RIA 等证实或测定纤维蛋白原的抗原浓度。实验五 凝血酶时间测定一、试管法【目的】 掌握凝血酶时间（thrombin time , T