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第二章 微生物的代谢调控机制n 通过代谢调节，微生物可最经济地利用其营养物，合成出能满足自己生长、繁殖所需要的一切中间代谢物，并做到既不缺乏也不剩余任何代谢物的高效“经济核算”。n 微生物细胞具有高度严密的自我调节能力，这对于微生物在工业上的应用，则有利也有弊。2.1 酶的调节机理n 微生物的自我调节作用都是通过协调控制酶来实现的，酶的生物合成受基因和代谢物的双重控制。2.1.1酶浓度的调控 2.1.1.1 酶的诱导合成n 组成酶：细胞所固有的，经常存在于细胞内，以恒定速度和恒定数量生成，不随微生物的代谢状态而变化的一类酶。n 诱导酶：在一般情况下细胞内不生成或数量很少，这些酶只有在底物或其结构类似物存在时才生成的一类酶。n 组成酶和诱导酶是相对的概念。n 酶的诱导合成现象是微生物普遍存在的，许多分解代谢的酶属于诱导酶类，有些合成酶（如细胞色素）也是诱导酶类。n 酶合成的诱导对于微生物的意义： 加强微生物对环境的适应能力。 避免了生物合成的原料和能量的浪费。2.1.1.2 酶合成的反馈阻遏n 当代谢途径中某终产物过量时，或培养基中已提供了此产物时，就会阻遏自身合成途径中第一个酶或其他关键酶的进一步合成，从而控制代谢的进行，减少终产物的生成。这种效应称为反馈阻遏。n 酶的阻遏在微生物中是很普遍的现象，常出现在与氨基酸、嘌呤、嘧啶的生物合成有关的酶中。n 阻遏的类型主要有末端代谢产物阻遏和分解代谢产物阻遏两种。（1）末端产物阻遏 指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起的阻遏。分支代谢途径n 多价阻遏作用：每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。代谢途径分支点以前的“公共酶”仅受所有分支途径末端产物的阻遏。n 积累阻遏：每个分支合成途径的终产物仅部分地阻遏初始酶的合成，且各阻遏的百分数，不管第二个阻遏物存在与否，都是一样的。（2）分解代谢产物阻遏n 二次生长现象n “葡萄糖效应”:葡萄糖干扰其他碳源利用的现象。n 随后的研究表明，葡萄糖效应并非由葡萄糖直接造成，而是其某种分解代谢产物所引起的。n 分解阻遏不仅仅限于葡萄糖，其他碳源和氮源也能起相同作用。n 分解代谢物的阻遏作用：指代谢反应链中，某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏代谢途径中一些酶合成的现象。n 分解代谢物阻遏对微生物的意义： 只要有一个容易同化的底物存在，细胞就不必耗费能量和原料去合成效率较低的途径的酶系，而使其代谢作用能更多地用于产生生长所必需的组分。 分解代谢物阻遏机制在不同的微生物、不同酶系中各异。 葡萄糖分解代谢物阻遏大肠杆菌降解乳糖的机制 2.1.1.3酶合成的诱导和阻遏的机制操纵子学说n 操纵子：在细菌基因组中，编码一组在功能上相关的蛋白质的几个结构基因，与共同的控制位点组成一个基因表达的协同单位。 n 结构基因：携带遗传信息n 操纵基因：与调节蛋白结合控制结构基因的转录n 启动子：与RNA聚合酶结合的部位n 调节基因：编码一种变构蛋白，有两个位点，一个位点与操纵基因结合，另一位点与调节物结合。操纵子分两类:n 一类是诱导型操纵子，只有当存在诱导物（一种效应物）时，其转录频率才最高，并随之转译出大量诱导酶，出现诱导现象。如乳糖操纵子。n 另一类是阻遏型操纵子，只有当缺乏辅阻遏物（一种效应物）时，其转录频率才最高。由阻遏型操纵子所编码的酶的合成，只有通过去阻遏作用才能起动。如色氨酸操纵子。2.1.2酶活性的调控 n 酶活性调节是通过改变已存在的酶分子活性来调节代谢速度，包括在酶活性的激活和抑制。n 调节酶活力比调节酶的合成更迅速、及时而有效。n 受反馈抑制的调节酶一般都是变构酶。n 异促变构酶分子由活性中心和调节中心组成。异促别构酶的作用程序如下：n 专一性的代谢物（变构效应物）与酶蛋白表面的特定部位（变构部位）结合 酶分子的构象变化（变构转换） 活性中心的修饰 抑制或促进酶活性。n 变构中心具有独立性，因此，变构酶经特定处理后，不丧失酶活性而失去对变构效应物的敏感性，即为脱敏作用。n 同促别构酶 酶分子中没有专门的调节中心，活性中心就是调节中心，底物就是调节物。2.1.2.1别构酶的动力学性质n 协同效应：先与酶活性中心结合的底物分子，对后继底物分子与酶分子中其他活性中心的结合所产生的影响。n 正协同效应：能提高酶对后继底物分子亲和力的效应。 n 正协同效应在代谢控制上的生理意义： 既可以快速调节细胞内底物浓度和代谢速度，又能保证细胞处于一个相对恒定的状态。n 负协同效应:降低酶对后继底物分子亲和力的效应。n 负协同效应的生理功能： 酶反应速度对底物浓度变化相对不敏感，这对于细胞内那些和多条代谢途径有联系的酶反应来说，能保证其恒定正常地工作。 例如，磷酸甘油醛脱氢酶对底物NAD+的结合具有负协同效应。2.1.2.2别构酶的活性调节机理 （1） MWC模式（2）KNF模式2.1.2.3别构酶对代谢的调节作用（1）异促别构酶的前体激活n 前体激活：代谢途径中后面的酶促反应，可被该途径中较前面的一个中间产物所促进。（2）反馈抑制的类型1)直线式代谢途径中的反馈抑制2)分支代谢途径中的反馈抑制n 其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶，同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用。协同反馈抑制n 指分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶，如果末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用的一种反馈调节方式。累积反馈抑制n 每一分支途径的末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中前面的酶，一种末端产物单独过量并不影响其它末端产物的形成，当几种末端产物共同存在时，由于它们的抑制作用是累积的，因而对途径中的第一个酶会产生较大的抑制。n 合作反馈抑制又称增效反馈抑制，系指两种末端产物同时存在时，可以起着比一种末端产物大得多的反馈抑制作用。顺序反馈抑制同功酶调节n 同功酶是指能催化相同的生化反应，但酶蛋白分子结构有差异的一类酶，它们虽同存于一个个体或同一组织中，但在生理、免疫和理化特性上却存在着差别。n 在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶所催化时，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。2.1.3微生物代谢调节的特性（1）酶活性调节与酶量调节的区别与配合n 区别：酶量的调节是在转录水平上阻遏或诱导酶的合成，但这种措施对于环境变化的反应比较迟缓；反馈抑制不涉及蛋白质的合成过程，这种调节比较直接、迅速和灵活。n 配合：当酶量调节与酶活性调节两者共存时，就能获得最大调节效果。前者称为粗调，后者称为细调。（2）终产物反馈调节与终产物浓度的关系n 终产物反馈调节取决于终产物浓度，保证了代谢过程中原料和能量的供应既无过剩又无短缺，使代谢在经济、节约的基础上顺利进行。（3）代谢途径中反馈调节的作用点n 反馈调节的作用点往往与调节酶有关。n 调节酶：主要是处在代谢途径中的不可逆步骤的酶、分支途径的第一个酶，以及异质代谢系（如糖、氨基酸、脂肪等）转换点的酶等。2.2微生物初级代谢的调节 n 初级代谢：微生物细胞在生长繁殖过程中，产生对细胞生长、分化和繁殖必需的物质的代谢。n 氨基酸、有机酸、核苷酸以及维生素等都属于初级代谢产物。 2.2.1 能荷的调节n 细胞中的能量状态通常用能荷（EC）表示，能荷计算公式：n 能荷：在全部腺苷酸中含有相当于ATP的数量的百分比。n 葡萄糖在有氧条件下的分解过程主要经过的阶段： 糖酵解生成乙酰辅酶A三羧酸循环。 n EMP途径HMP途径 n TCA循环 n CO2固定反应n 乙醛酸(DCA)循环n DCA环的作用弥补TCA环中由于缺乏四碳化合物所引起的二碳化合物不能被充分氧化的缺陷。以二碳化合物作为唯一碳源培养微生物，必须靠DCA环来补充TCA环。 在脂肪转化成糖的过程中起“齿轮”作用。n 脂肪脂肪酸乙酰CoA草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸葡萄糖。能荷对酵解途径及三羧酸循环的调节 n 当能荷降低时，则激活催化糖分解的某些酶或解除ATP对这些酶的抑制，并抑制糖原合成酶，1，6-二磷酸果糖酯酶的活性，从而加速了糖酵解，三羧酸循环的产能过程。反之亦然。n 巴斯德效应：酵母菌在有氧时，酒精的产量下降，糖的消耗速度减慢。 2.2.2 微生物膜的调节n 以代谢产物为目标的发酵对细胞膜的透性的要求：第一，容许营养物质进入细胞；第二，对中间产物的透出性不大；第三，目的产物形成后可以尽快透出细胞膜进入环境。n 膜的透性磷脂双分子层的磷脂含量脂肪酸含量脂肪酸合成n 生物素缺陷型微生物，在培养时限量添加生物素，则可以调节膜的透性。2.3微生物次级代谢的调节n 次级代谢：从初级代谢产生的中间产物出发，合成一些生理功能不够明确、化学结构特殊、与维持生命活动无关、并不影响生命活动的代谢产物的过程。2.3.1次级代谢的生理功能n 次级代谢可维持初级代谢的平衡n 次级代谢产物是贮藏物质的一种形式n 使菌体在生存竞争中占优势2.3.2次级代谢产物的生物合成2.3.3 次级代谢的特点次级代谢以初级代谢产物为前体，并受初级代谢的调节n 分叉中间体：在菌体代谢过程中，那些营养物质代谢的中间体既可以用来合成初级代谢产物，又可以生成次级代谢产物的化合物。如丙二酰辅酶A 是一种分叉中间体。n 次级代谢途径不是孤立存在的，而是与初级代谢途径密切相关。次级代谢产物一般在菌体生长后期合成n 初级代谢自始至终存在于一切生活的机体中，同机体的生长过程呈平行关系n 次级代谢一般可明显地表现为机体的生长期和次级代谢产物生产期二个不同的时期。n 合成次级代谢物的关键酶基因在生长期处于阻抑状态。 杆菌肽、放线菌素等抗生素关键的合成酶都在生长末期出现 生产期前期加入氯霉素等蛋白质合成抑制剂可阻止新酶的出现 。相关酶的专一性不同：n 相对来说催化初级代谢产物合成的酶专一性强，催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强。初级代谢产物的合成具有菌株特异性 n 次级代谢的某物质的合成，仅存在于个别菌种中，与分类地位无关。 次级代谢产物对环境条件变化敏感n 初级代谢产物对环境条件的变化敏感性小， 而次级代谢产物对环境条件变化很敏感。n 抗生素的生物合成过程是一种由多基因控制的代谢过程。这些基因不仅位于微生物的染色体中，也可位于染色体外的遗传物质中。 2.3.4次级代谢产物生物合成作用的调节和控制机制（1）诱导调节n 参与抗生素一类次级代谢产物合成的酶是通过诱导作用合成的 n 例如：链霉素合成中A因子的诱导作用 n 微生物细胞的生长速率降低诱导参与次级代谢作用的酶的合成 细胞生长繁殖而进行的初级代谢活动已不能平衡地进行，结果会造成某些中间产物发生积累，从而成为诱导参与次级代谢作用的酶合成的诱导剂 菌体细胞生长速率使细胞内已经被合成的生物大分子物质的转化作用加强，造成具有诱导作用的低分子物质的浓度升高而产生诱导作用。（2）反馈调节1）抗生素自身积累的反馈调节 n 抗生素工业生产中，大量积累的抗生素会引发反馈调节。2）前体物的反馈调节n 前体物的减少将使抗生素合成中的“原料”不足，导致抗生素的产量下降。n 青霉素的合成受到缬氨酸反馈调节的影响 选育出乙酰羟酸合成酶对缬氨酸的反馈抑制敏感性较小的突变株，提高酶量，细胞内可积聚较多的内源缬氨酸，从而提高青霉素的产量。3）分支途径的初级代谢物的反馈调节n 某些情况下，初级代谢产物反馈调节共同途径中的酶影响抗生素的合成。（3）分解代谢产物调节1）碳分解产物调节n 被快速利用的碳源的分解产物，阻遏了次级代谢的酶系的合成，只有当这类碳源消耗尽之后，阻遏作用被解除，菌体才由生长阶段转入次级代谢产物的合成阶段。 乳糖比葡萄糖适合青霉素的发酵。研究表明，葡萄糖分解产物阻遏了青霉素合成中关键酶-酰基转移酶。 除葡萄糖外，柠檬酸分解产物也具有阻遏作用。 例如：新霉素产生菌雪白链霉菌当培养基中柠檬酸和葡萄糖同时存在时，菌体先利用柠檬酸，此时不合成新生霉素，柠檬酸被利用完了，利用葡萄糖时才合成新生霉素。 在生产中为避免碳分解物的阻遏作用，可以采取一些措施，加入缓慢利用的碳源或连续流加碳源或使用缓慢释放营养物的颗粒剂等。2）氮分解代谢产物调节n 在次级代谢中，铵盐和其他快速利用的氮源可能对抗生素生物合成产生调节作用。n 以蛋白质作氮源，可以促进抗生素的合成，以无机氮等容易利用的氮作氮源，可以促进产生菌的生长，而抑制抗生素的合成。n NH4+的作用不是直接抑制抗生素合成酶的活性，而是在早期影响合成酶的形成或合成途径中的某一个酶的合成。 n 在选择供生产抗生素的氮源物质时，常常会选到那些不易被抗生素产生菌利用的氨基酸，使之起着氮源供应的限制作用。 灰色链霉素进行链霉素发酵，使用脯氨酸作唯一氮源时能大幅度地提高链霉素的产量。 在抗生素发酵工业中黄豆饼粉是首选的氮素营养物质。硝酸盐对林肯链霉菌合成林可霉素的促进作用硝酸盐不是作为氮源被利用, 而是其代谢中间物影响了林可霉素合成的关键酶系。硝酸盐对地中海诺卡氏菌合成力复霉素的促进作用（4）磷酸盐的调节作用n 磷酸盐对许多抗生素和其他一些微生物次级代谢产物具有明显的阻遏和抑制作用。 无机磷促进初级代谢作用，抑制次级代谢作用n 磷是微生物进行平衡生长的限制因素之一。在磷充足时，细胞生长处于平衡状态，次级代谢作用被抑制；在磷的供应不足时，细胞生长处于不平衡状态，次级代谢作用便被活化。磷抑制或阻遏对次级代谢产物合成所必需的磷酸酯酶n 在磷酸存在时，链霉素磷酸酯酶的活性被抑制，但是它们的合成不受磷的阻遏。n 在新霉素的生物合成中，磷酸盐同样控制磷酸酯酶的活性，而且它的合成受磷酸盐阻遏。n 生产上一般是通过诱变育种，筛选对磷酸盐反馈调节脱敏突变株，即耐磷高产菌株 。2.4 研究生物合成的方法2.4.1 试验材料处理（1）整体细胞n 整体细胞水平进行代谢试验，通常采用静息细胞。 n 静息细胞：是将细胞培养到一定阶段的菌体以缓冲液或生理盐类混合液等洗涤菌体，有时还继续在生理盐水中培养一段时间，使细胞内代谢物被消耗掉，使之呈饥饿状态，如此获得的细胞。 优点：n 细胞保持了正常状态。缺点：n 不能正确判明某一物质的代谢变化途径和中间产物，更不能知道它在何种细胞器中进行，以及催化其各步反应的酶和调节因子。n 由于细胞质膜通透障壁存在，许多物质不能渗入细胞。 （2）无细胞制剂 n 无细胞制剂：将完整细胞用适当方法如超声波、溶菌酶处理，将其破碎，所得细胞内容物。优点：n 除去了细胞膜障壁，而仍然保持细胞内的酶活性，从而使许多原来不能渗入细胞的物质可以参加代谢作用。 缺点：n 细胞整体受到破坏，而体系仍然复杂。 （3）亚细胞组分制剂 n 在真核微生物细胞中，各种酶系被细胞器隔离分布，代谢活动只能在特定的部位上进行。如与呼吸产能有关的酶系集中于线粒体内膜上。 n 原核微生物细胞结构也划分出不同的区域，对于某一代谢途径有关的酶系则集中某一区域 。例如，呼吸的酶系集中在细胞质膜上。 无细胞制剂通过超离心技术可将各种细胞器以及细胞原生质可溶组分分开，制备成各种亚细胞组分制剂。 优点： 可能对细胞各个组分分别进行试验研究，使代谢研究深入到细胞器水平。 缺点：n 亚细胞组分离开了整体，不免带进人为的因素。 （4）酶提取液和提纯酶 n 利用酶的提取和纯化手段可以制得微生物细胞的酶粗提液和纯化酶。 n 酶的粗提液：可以利用酶对底物的专一性进行许多代谢反应包括个别反应和系列反应的研究试验n 纯化酶：能深入到个别代谢反应的作用历程和机理水平。（5）人工重组体系 n 人工重组体系：将某些系列反应的酶或亚细胞组分逐一分离出来，然后再按已有的认识，将它们重新组合起来进行代谢研究，使发生于整体细胞、细胞器或酶粗提液的复杂反应在试管内重演。n 是验证方法之一。2.4.2 代谢途径的探讨 n 微生物中间代谢由许多连续的生物化学反应组成，证明这些步骤存在的可靠而直接的方法是将这些中间步骤的各种中间产物分离分析出来。n 常用的研究方法有酶活性的抑制、生化突变菌株法、同位素标记法、酶活测定等。（1）酶活性的抑制 n 在反应体系中加进某种专一的酶的抑制剂，使该酶催化的反应不能进行，便可使该步反应之前的中间产物积累，得以分离分析。 （2）放射性同位素示踪法 n 同位素是指原子量不同的元素，其原子核结构不稳定，它会自行发生变化，在变化过程中会放出射线，可用仪器测定放射性同位素的含量。n 如果向生长着的微生物细胞培养基质中加入某一生物合成途径的中间产物，它就会像正常的中间产物一样参与合成过程，产生各种具有放射性活性的产物。分离、鉴定这些产物就可以为确定代谢途径提供依据。 n 用这种方法可以在微生物生长期间进行连续追踪观察。例如，利用放射性磷研究大肠杆菌的磷代谢。 n 也可以采用放