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第八章 细胞核与染色体1Nuclear EnvelopeNuclear Envelope,位于间期细胞核的最外层，是细胞核和细胞质之间的界膜。 生物学意义：一方面构成核、质之间的天然选择性屏障；避免生命活动的彼此干扰；保护DNA不受细胞骨架运动所产生的机械力的损伤。另一方面介导核质之间的物质交换与信息交流 。 是包在核外的双层膜结构。它将DNA与细胞质分隔开，形成核内特殊的微环境，保护DNA分子免受损伤；使 DNA的复制和RNA的翻译表达在时空上分隔开来；此外染色体定位于核膜上，有利于解旋、复制、凝缩、平均分配到子核，核被膜还是核质物质交换的通道。 1.1核被膜是双层膜结构1.1.1Structure外核膜outer nuclear membrane，附有核糖体颗粒 内核膜inner nuclear membrane，有特有的蛋白成份（如LBR） 核纤层nuclear lamina 核周间隙perinuclear space 核孔nuclear pore 核纤层：位于内核膜的内表面的纤维网络，可支持核膜，并与染色质及核骨架相连。 核纤层由核纤层蛋白（lamin）构成， lamin是一类中间纤维，分为A、B两型。 核纤层的作用： 1保持核的形态： 2参与染色质和核的组装：核纤层在细胞分裂时呈现出周期性的变化，在间期核中，核纤层提供了染色质（异染色质）在核周边锚定的位点。在前期结束时，核纤层被磷酸化，核膜解体。其中B型核纤肽与核膜残余小泡结合，A型溶于胞质中。在分裂末期，核纤肽去磷酸化重新组装，介导了核膜的重建。 1.1.2核被膜在细胞周期中的崩解与装配新核膜来自旧核膜，且核被膜的去组装是非随机的，具有区域特异性domain-specific。 1.2Nuclear Pore Complex,NPC内外核膜在某些部位相互融合，形成环状开口，称为核孔Nuclear pore,在核孔上镶嵌着由多种蛋白质构成的复杂结构，称为核孔复合体Nuclear Pore Complex,NPC。 一般哺乳动物细胞平均有3000个核孔。 细胞核活动旺盛的细胞中核孔数目较多，反之较少。 Fish Trap Model 1.胞质环cytoplasmic ring，外环； 2.核质环nuclear ring，内环； 3.辐spoke,可分三个结构域 柱状亚单位（column subunit） 腔内亚单位(luminal subunit) 环带亚单位（annular subunit） 4.中央栓central plug，又称transporter。 电镜下观察，核孔是呈圆形或八角形，一般认为其结构如fish-trap，主要包括以下几个部分：胞质环（cytoplasmic ring），位于核孔复合体胞质一侧，环上有8条纤维伸向胞质；核质环（nuclear ring），位于核孔复合体核质一侧，上面伸出8条纤维，纤维端部与端环相连，构成笼子状的结构；转运器（transporter），核孔中央的一个栓状的中央颗粒；辐（Spoke）：核孔边缘伸向核孔中央的突出物。 1.2.1The composition of NPC构成核孔复合体的蛋白统称为“核孔蛋白” nucleoporin，Nup。 核孔复合体主要由蛋白质构成，其总相对分子质量约为125106，推测可能含有100余种不同的多肽，共1 000多个蛋白质分子。 Nup的两类代表： gp210：结构性跨膜蛋白； p62：功能性的核孔复合体蛋白,具有两个功能结构域。 1.2.2The function of NPCNPC的功能：核质交换的双向、双功能、选择性亲水性通道。 双向：入核、出核； 双功能：被动运输、主动运输。 (一)通过NPC的被动运输 根据资料推测，NPC的中央通道在介导被动运输时直径约为9nm，相当于可以允许60kDa以下的球形蛋白自由通过； 由于各种因素的影响，并不是所有直径10nm以下的分子在核被膜两侧均匀分布； (二)通过NPC的主动运输 1.选择性和双向性 对运输颗粒大小的限制：有效功能直径可被调节约1020nm，甚至可达26nm； 主动运输是一个信号识别与载体介导的过程，需要消耗能量，并表现出饱和动力学特征； 主动运输具有选择双向性，即选择性地对不同的物质进行核输入或核输出 。 2.亲核蛋白与核定位信号 亲核蛋白（karyophilic protein）: 在细胞质内合成后，需要或能够进入细胞核内发挥功能的一类蛋白质. 核定位信号（nuclear localization signal，NLS）：引导蛋白质进入细胞核的一段信号序列。受体为importin。 第一个被确定的NLS是病毒SV40的T抗原，序列为：pro-pro-lyslys-lys-Arg-Lys-val。 NLS对连接的蛋白质无特殊要求，完成输入后不被切除。 Ran蛋白，一类G蛋白，调节货物复合体的解体或形成。 3. 出核转运和核输出信号 不同RNA的出核转运： RNApol I转录的rRNA分子：以RNP的形式离开细胞核，需要能量； RNApol III转录的5s rRNA与 tRNA的核输出由蛋白质介导； RNA pol II转录的hn RNA，在核内进行5端加帽和3端附加PolyA序列以及剪接等加工过程，然后形成成熟的mRNA出核； 核输出信号（nuclear export signal, NES），引导RNP输出细胞核，受体为exportin。 mRNA的出核转运过程是有极性的，其5端在前，3端在后。 2ChromatinChromatin VS Chromosome 染色质（chromatin）: 指间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量 RNA组成的线性复合结构, 是间期细胞遗传物质存在的形式。 染色体(Chromosome): 指细胞在有丝分裂或减数分裂过程中, 由染色质聚缩而成的棒状结构。 染色质与染色体是在细胞周期不同的功能阶段可以相互转变的的形态结构染色质与染色体具有基本相同的化学组成，但包装程度不同,构象不同。 2.1Chemical composition组成：DNA、组蛋白Histone、非组蛋白Nonhistone、少量RNA。 DNA:Histone较为稳定，约1:1；DNA:Nonhistone变化较大；DNA:RNA约为10:1。 2.1.1DNA凡是具有细胞形态的所有生物其遗传物质都是DNA。在真核细胞中，每条未复制的染色体包装一条DNA分子。 Genome：一个生物贮存在单倍染色体组中的总遗传信息，称为该生物的基因组。 （一）DNA分子一级结构具有多样性 1.单一序列； 2.中度重复DNA序列 ； 短散在重复元件（short interspersed elements，SINEs） 长散在重复元件（long interspersed elements，LINEs） 3.高度重复DNA序列 卫星DNA（satellite DNA），主要分布在染色体着丝粒部位； 小卫星DNA（minisatellite DNA），又称数量可变的的串联重复序列，常用于DNA指纹技术（DNA finger-printing）作个体鉴定； 微卫星DNA（microsatellite DNA）重复单位序列最短，具高度多态性，在遗传上高度保守，为重要的遗传标志。 （二）DNA二级结构具有多形性 B-DNA、Z-DNA、A-DNA。 2.1.2Histone真核生物染色体的基本结构蛋白，带正电荷(?)，富含Arg，Lys，属碱性蛋白，共5种，分为： 核心组蛋白（core histone）：H2A、H2B、H3、H4； 连接组蛋白（linker histone）：H1。 结构： 核心组蛋白高度保守，没有种属及组织特异性，尤其是H4。 H1是多样性，具有一定的属(genus)和组织特异性。 2.1.3Nonhistone非组蛋白具多样性和异质性； 对DNA具有识别特异性，又称序列特异性DNA结合蛋白 (sequence specific DNA binding proteins)； 功能：帮助DNA折叠；协助DNA复制；调节基因表达。 多以-helix和DNA大沟识别并结合，进而影响复制和转录。 非组蛋白和DNA不同的结合模式： 1.螺旋-转角-螺旋模式(helix-turn-helix motif) 2.锌指模式(Zinc finger motif) 3.亮氨酸拉链模式(Leucine zipper motif，ZIP) 4.螺旋-环-螺旋结构模式(helix-loop-helix motif，HLH) 5.HMG-盒结构模式（HMG-box motif）。 2.2Nuleosome染色质的基本结构单位核小体(nucleosome)。 2.2.1Main experimental proof1.铺展染色质的电镜观察 2.用非特异性微球菌核酸酶消化染色质，部分酶解片段分析结果. 3.应用X射线衍射、中子散射和电镜三维重建技术研究. 核小体颗粒是直径为11nm、高6.0nm的扁园柱体，具有二分对称性。核心组蛋白的构成是先形成(H3)2.(H4)2四聚体，然后再与两个H2AH2B异二聚体结合形成八聚体。 4. SV40微小染色体（minichromosome）分析与电镜观察。 SV40DNA为环形，约5.0Kb,若200bpDNA包装成一个核小体，则可形成25个核小体。 2.2.2核小体结构要点1.每个核小体单位包括200bp左右的DNA超螺旋和一个组蛋白八聚体核心(Core)及一个分子H1； 2.由H2A、H2B、H3、H4各两分子形成八聚体，构成核心颗粒； 3.146bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈, 组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bp DNA，锁住核小体DNA的进出端，起稳定核小体的作用； 4.两个相邻核小体之间以连接DNA 相连，典型长度60bp，不同物种变化值为080bp； 5.组蛋白与DNA之间的相互作用主要是结构性的，基本不依赖于核苷酸的特异序列； 6.核小体沿DNA的定位受不同因素的影响，进而通过核小体相位改变影响基因表达。 2.3The Packing Model of Chromatin人体的一个细胞核中有23对染色体，每条染色体的DNA双螺旋若伸展开，平均长为5cm，核内全部DNA连结起来约1.72.0m。 2.3.1多级螺旋模型multiple coiling model一级结构：核小体Nucleosome 二级结构：螺线管(solenoid) 电镜下观察用温和方法分离的染色质是直径30nm的纤维，这种纤维的由核小体螺旋化形成，每6个核小体绕一圈，长度压缩6倍。 三级结构：超螺线管(supersolenoid) 四级结构：染色单体（chromatid） DNA 压缩7倍 核小体 压缩6倍 螺线管 压缩40倍 超螺线管 压缩5倍 染色单体 2.3.2 骨架-放射环结构模型scaffold radial loop structure model认为30nm的纤维折叠为一系列的环（loop），沿染色体纵轴结合在染色体骨架chromsomal scaffold。 由螺线管形成DNA复制环,每18个复制环呈放射状平面排列, 结合在核基质上形成微带(miniband)。 染色体包装的不同组织水平：染色体包装的实际形式可能是多种机制（模型）的融合。 2.4Euchromatin & Heterochromatin间期核中染色质可分为常染色质(enchromatin）和异染色质（heterochromatin）。 2.4.1 Enchromatin概念：指间期核内染色质纤维折叠压缩程度低, 处于伸展状态, 用碱性染料染色时着色浅的那些染色质。 DNA包装比约为1 0002 000分之一；主要由单一序列 DNA 和中度重复序列DNA构成。 并非所有基因都具有转录活性,常染色质状态只是基因转录的必要条件而非充分条件 2.4.2Heterochromatin概念：指间期核内染色质纤维折叠压缩程度高, 处于聚缩状态, 用碱性染料染色时着色深的那些染色质。 类型： 结构异染色质(组成型异染色质)constitutive heterochromatin ； 概念：存在于各种细胞中，除复制期以外在整个细胞周期均处于聚缩状态，DNA包装比在整个细胞周期没有较大变化的异染色质。 特点：在中期染色体上多定位于着丝粒区、端粒、次缢痕及染色体臂的某些节段； 由相对简单、高度重复的DNA序列构成, 如卫星DNA； 具有显著的遗传惰性, 不转录也不编码蛋白质； 在复制行为上与常染色质相比表现为晚复制早聚缩； 在功能上参与染色质高级结构的形成，导致染色质区间性；作为核DNA的转座元件，引起遗传变异。 兼性异染色质facultative heterochromatin 。 概念：在某些细胞类型或一定的发育阶段, 原来的常染色质聚缩, 并丧失基因转录活性, 而形成的异染色质。 异染色质化可能是关闭基因活性的一种途径。 如：巴尔氏小体(Barr body):雌性哺乳动物类细胞核内，两条X染色体之一在发育早期随机发生异染色质化而失活，在上皮细胞核内，这个异固缩的X染色体称为巴尔氏小体。 雌性哺乳类动物的X染色体就是一类特殊的兼性异染色质。在哺乳动物细胞内如有两个X染色体（通常为雌性），则其中的一个染色体常表现为异染色质，称巴氏小体（barr body）。人的胚胎发育到16天以后，一条X染色体转变为巴氏小体，呈块状紧靠核膜，染色反应表现为深染。因此通过检查羊水中胚胎细胞的巴氏小体可预测胎儿的性别。 3Chromosome3.1Metaphase chromosome有丝分裂中期染色体具有最高的压缩比，形态结构典型。 两条染色单体以着丝粒相连，互称Sister chromatid。 3.1.1中期染色体的类型根据着丝粒在染色体上的位置，将中期染色体分为四类： 中着丝粒染色体(metacentric chromosome) 亚中着丝粒染色体(submetacentric chromosome) 亚端着丝粒染色体(subtelocentric chromosome) 端着丝粒染色体(telocentric chromosome)。 划分的标准有： 着丝粒比r（长臂长/短臂长） 着丝粒指数i(短臂长/染色体长)100%， 短臂长臂比 3.1.2中期染色体的结构(1)着丝粒(centromere)与着丝点(动粒，kinetochore) 着丝粒Centromere，主缢痕 primary constriction:中期染色体上一个染色较浅而缢缩的部位，连接两个染色单体。 Kinetochore,着丝点、动粒：主缢痕处两个染色单体外侧与纺锤体微管连接的蛋白质复合结构。 着丝粒的结构 1、动粒结构域（kinetochore domain）： 位于着丝粒的表面，包括三层板状结构和围绕外层的纤维冠(fibrous corona)。 2、中央结构域(central domain)：位于着丝粒结构域的下方。其中含有高度重复的卫星DNA，CENP-B框与动粒蛋白作用。 3、配对结构域(pairing domain)： 内部着丝粒蛋白INCENP(inner centromere protein)； 染色单体连接蛋白clips(chromatid linking proteins)。 (2)次缢痕(secondary constriction)：除主缢痕外，染色体上其它呈浅缢缩的部分称次缢痕，次缢痕的位置相对稳定，是鉴定染色体个别性的一个显著特征。 (3)随体（satellite）：指位于染色体末端的球形染色体节段，通过次缢痕区与染色体主体部分相连。 (4)核仁组织区(nucleolar organizing region,NOR):是rDNA (rRNA基因)所在的区域。能够合成核糖体的28S、18S和5.8S rRNA(5SrRNA基因除外)。核仁组织区位于染色体的次缢痕区，但并非所有的次缢痕都是NORs. (5)端粒(telomere) ：是染色体端部的特化部分。 端粒由高度重复的短序列串联而成，在进化上高度保守，不同生物的端粒序列都很相似，人的序列为TTAGGG。 端粒生物学作用之一在于维持染色体的独立性和完整性。 作用之二是起“细胞分裂计数器”的作用。 3.2染色体DNA的三种功能元件在细胞世代中确保染色体的复制和稳定遗传，染色体至少应具备三种基本功能元件functional elements，对应的DNA序列称为“染色体DNA的功能元件”。 1.DNA复制起点自主复制DNA序列autonomously replicating DNA sequenceARS：DNA复制的起点。 2.着丝粒着丝粒DNA序列centromere DNA sequence,CEN：参与形成着丝粒，使细胞分裂中染色体能够准确地分离 3.端粒端粒DNA序列(telomere DNA sequence,TEL) ：保持染色体的独立性和完整性。 一般情况下，每个真核细胞染色体具多个ARS(如酵母中含200400个)，一个CEN，两个TEL。 Leu-型酵母细胞的转染实验证明三种功能元件的必要性。 三种功能元件的结构特点： 1.ARS:大多数具有一个11bp富含AT的一致序列（ARS consensus sequence, ACS），及其上下游各200bp左右的区域是维持ARS功能所必需的。 2.CEN:由大量串联的重复序列组成，如卫星DNA;两个相邻的核心区：80-90bp的AT区；11bp的保守区。 3.TEL:由高度重复的端粒序列构成，人的序列为TTAGGG是由端粒酶Telomerase合成后添加上的。 The Telomerase & “The End-replication Problem” Telomerase:一种核糖核蛋白复合物，具有逆转录酶活性，以物种专一的内在RNA作为模板，把合成的端粒重复序列添加到染色体DNA的3末端。 端粒和细胞衰老 在动物细胞中，只有生殖系细胞和部分干细胞中存在Telomerase活性，因此端粒起到细胞分裂计数器的作用：随细胞分裂，端粒逐渐缩短。 端粒和细胞衰老关系密切。如：Dolly的端粒和正常羊相比短20，同时Dolly和正常羊相比表现为早衰、早亡。 肿瘤细胞具有表达端粒酶活性的能力，故能无限增殖。 人造微小染色体artificial minichromosome 1983年，A. W. Murray等人首次成功构建了包括ARS、CEN、TEL和外源DNA，总长度为55kb的酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)。 YAC可用于转基因和构建基因文库，容纳插入片段的能力远高于质粒。 3.3核型和染色体显带核型（karyotype）是细胞分裂中期染色体特征的总和，包括染色体的数目、大小和形态特征等方面。如果将成对的染色体按形状、大小依顺序排列起来叫核型图(karyogram)，而染色体组型idiogram通常指核型的模式图，代表一个物种的模式特征。 染色体分带技术是经物理、化学因素处理后，再用染料对染色体进行分化染色，使其呈现特定的深浅不同带纹（band）的方法。分带技术可分为两大类，一类是产生的染色带分布在整过染色体的长度上如：G、Q和R带，另一类是局部性的显带，它只能使少数特定的区域显带，如C、Cd、T和N带。 染色体显带：经物理、化学因素处理后，再用染料对染色体进行分化染色，使其呈现特定的深浅不同带纹（band）的方法。 分带技术可分为两类： 一类是产生的染色带分布在整过染色体的长度上如：Q、G和R带， 另一类是局部性的显带，如C、Cd、T和N带。 Q带是最早出现的染色体显带技术，富含GC区为暗带。 G带所显带纹与Q带相符。 C带显示的是着丝粒异染色质。相应地，T带显示端粒；N带显示NORs。 3.4Giant chromosomesGiant chromosomes：在某些细胞中存在的体积巨大的染色体。包括：多线染色体（polytene chromosome）；灯刷染色体（lampbrush chromosome）。 3.4.1Polytene chromosome存在于双翅目昆虫的幼虫组织细胞、某些植物细胞。 特点： 体积巨大，是由于核内有丝分裂(Endomitosis)的结果； 多线性； 体细胞联会(同源染色体配对)； 具有带和间带。 具有胀泡puff和巴氏环（Balbiani ring）。 带区Band和间带Interband的染色质相比有更高的包装程度;带和间带都含有基因，可能管家基因(housekeeping gene) 位于间带, 奢侈基因(luxury gene) 位于带上。 胀泡Puff，是线染色体中一些疏松膨大的带区。被认为是基因活跃转录的形态学标志 。 3.4.2Lampbrush chromosomelampbrush chromosome，普遍存在于动物界的卵母细胞，两栖类卵母细胞的灯刷染色体最典型。由于染色体主轴两侧有侧环，状如灯刷，故名灯刷染色体。 灯刷染色体的来源：卵母细胞进行减数第一次分裂时停留在双线期的染色体。 侧环是RNA活跃转录的区域。 4Nucleonus核仁是真核细胞间期核中最显著的细胞器，在活细胞用普通光学显微镜便可看到，这是由于核仁的折光性强，与细胞其他结构可显出明显的界限。在细胞核内呈浓密的球状小体。据报道，这个细胞器最早是有Fontana于1881年首次发现。 核仁（nucleolus）见于间期的细胞核内，呈圆球形，一般12个，有时多达35个。主要功能是转录rRNA和组装核糖体单位。 一般蛋白质合成旺盛和分裂增殖较快的细胞有较大和数目较多的核仁，反之核仁很小或缺如。 核仁在分裂前期消失，分裂末期又重新出现。 4.1Ultrastructure of Nucleolus1.纤维中心(fibrillar centers，FC)：是被致密纤维包围的一个或几个低电子密度的圆形结构，主要成分为RNA聚合酶和rDNA，这些rDNA是裸露的分子(没有组蛋白核心) 。 2.致密纤维组分(dense fibrillar component，DFC)：呈环形或半月形包围FC，由致密的纤维构成，是新合成的RNP，转录主要发生在FC与DFC的交界处。 3.颗粒组分(granular component，GC)：由直径15-20 nm的颗粒构成，是不同加工阶段的RNP。 除上述三种基本组分外，还包括： 核仁基质（(nucleolar matrix)； 核仁相随染色质(nucleolar associated chromatin)：又分为，核仁内染色质Nucleolar chromatin和核仁周边染色质Perinucleolar chromatin。 4.2Functions of Nucleolus其主要功能是核糖体的生物发生(ribosome biogenesis)，是 一个向量过程(vetorical process)：从核仁纤维组分开始, 再向颗粒组分延续。 这一过程包括rRNA的合成、加工和核糖 体亚单位的装配。 核仁的另一个功能涉及mRNA的输出与降解。 4.2.1Transcription of rRNA组织特征: 位于NORs的rDNA是rRNA的信息来源。 rRNA基因是重复的多拷贝