纯化操作规程.doc

纯化操作规程 1 纯化内容及目的纯化前，详细咨询合成人员，并记录下列内容：1.1 样品名称纯化命名时严格承接合成名称。详见技术部产品批号编制。1.2 样品重量此处指经裂解后直接上机前样品重量。无论对于已抽干样品（多呈粉末状，与实际重量相近）或某些尚未抽干或者未进行抽干处理的样品（多呈粘稠溶液状或胶状，其重量与实际重量相差可能较远），都需详细记录。1.3 预计目的肽含量指样品中含有目的肽的大致mg数，由合成人员提供。1.4 要求的目的肽数量及纯度即产品指标，如不同纯度（如仅脱盐、或80%、90%、95%等）以及相应的mg数。1.5 后处理方法样品在合成过程中，后处理方法的不同，可能对纯化方法与结果判断有一定影响。此时应详细咨询合成人员并记录。2 样品溶解性能的预备实验鉴于肽类样品的等电点（pI）、溶解性能将直接影响到纯化工作。为谨慎起见，在处理新样品前，必须对其溶解性能进行预备实验。2.1 理化性质分析首先利用蛋白分析软件对目的肽的理化性质进行序列分析，主要包括：分子量、pI、疏水性与亲水性、最大吸收峰等，并记录。2.2 粗肽成分分析合成时的不同处理方法对于样品所含组分也有很大影响，应详细咨询合成人员该样品合成与裂解过程中是否有特殊处理、合成过程中对该样品的性质有何体会等。2.3 实验程序理化性质对于样品纯化仅具有部分指导意义，对于粗肽而言，其许多性质在盐溶液中都会发生变化，一切均以实际验证为准。2.3.1 取少量样品（10mg左右）加入到洁净试管；2.3.2 加入2ml过滤无热源水，置于旋涡混合器快速混合23min，观察是否完全溶解。如溶解，则视为易溶样品（5mg/ml），可进行大量溶解。否则进行下一步。2.3.3 以pH试纸粗略测定样品溶液pH值（多显酸性），结合pI值，以0.1M NaOH或0.1M HCl逐滴加入，并不断混合或搅拌，直至样品溶解，此时测定溶液pH值（需控制在pH210之间为宜，视不同类型柱子而定）。如不溶则进行下一步处理。2.3.4 振荡或搅拌下，逐滴加入ACN，至浓度为510%，混合，观察是否溶解。2.3.5 一般样品通过上述处理均可溶解，如最后仍观察到不完全溶解，则选取最佳条件，仍按大量溶解方法处理。3 样品大量溶解3.1 操作要求粗肽溶解时体积应尽量小，因而溶解液浓度一般很大,此时即使溶液极小的损失也意味着整个样品较大的损失，所以要求一定操作严格，手法熟练，回收细心。3.2 操作程序3.2.1 选取合适的溶解液如已确定方法的样品，一般以初始洗脱液（或其它已证实有效的溶液）；对于新样品，采用预备实验确定的最适宜的溶解条件。3.2.2 溶解首先将样品仔细称重，注意记录样品名、称取数量、剩余瓶重等。对于易溶样品,以一次性注射器吸取适量溶解液,加入，适当超声振荡，使之完全溶解；对于部分溶解样品,转入试管中,加5ml溶解液,在旋涡混合器上快速混合5min(注意混合均匀、不可洒出)。离心(注意平衡)10min(3000rpm)。取出上清液,将底部沉淀以溶解液复溶。再次离心,复溶,直至试管内无沉淀。经反复溶解后,仍存在的不溶性颗粒,必须收集待查,不应轻易弃去，必须收集留用。对于整瓶溶解的样品，以一次性注射器吸取溶解液，仔细冲洗杯壁附着的样品，并回收。注意：在此过程中，以及以下的整个纯化实验过程中，均采用经高温灭菌的玻璃器皿。3.2.3 过滤装滤器。选择合适大小的滤器及水相滤膜，将滤膜在溶解液中浸润后安装，以注射器打入空气检验是否泄露。过滤。以一次性注射器吸取少量样品溶液（2ml）进行过滤。注意用力均匀，力过大会使液体由滤器接缝处挤出甚至使滤膜破裂损失样品。滤液应澄清。多次过滤后，如滤膜堵塞，换新膜。取下的滤膜置于烧杯中备用，最后以溶解液超声波处理，回收。样品溶液应仔细回收，滤膜最后吸取溶解液进行过滤以冲下滤器中样品溶液，回收。滤器处理：滤器用后，取下滤膜，置于盛有1M NaOH的容器中，集中处理（煮沸15min，无热源水洗净，测pH接近中性后，再加入无热源水，煮沸5min，继续以无热源水冲洗，至pH恢复到无热源水的pH，将滤器置于烘箱5060烘干，备用）。3.2.4 记录详细记录溶解的样品名称、批号、数量、溶解方法、溶解性能、最终体积等。4 纯化实验鉴于纯化所用机型、柱、目的等不同，此处只简述主要注意事项：4.1 谨慎回收原则上，每次纯化各峰均应回收，清楚标注，置于冰箱备用。只有当完全确定目的峰已经得到后方可处理。4.2 小样预备实验每换一种样品,当色谱柱平衡后,即进行小样预备试验,试验成功后方可正常进样。4.3 溶液处理方法进行HPLC的溶液应按要求进行处理。水、有机溶剂、水/有机溶剂等溶液He气脱气完全（10min左右）。Buffer/有机溶液，则先5 合并收集5.1 即使在纯化条件已经确定的条件下，每次纯化后各峰也只能分开收集，待已确认后方可合并。5.2合并时标注清楚样品名称、批号、纯化批次、出峰号、主峰好等，并仔细记录。6 旋蒸6.1 为提高生产效率，保证产品质量，纯化后收集液需经过旋转蒸发后才可进行冻干。6.2 收集各峰后，如当天不进行旋蒸，则置于冰箱内冰冻保存。如当天旋蒸，置于-4保存。严禁反复冻融。6.3 旋蒸仪使用参见旋转蒸发仪操作规程6.3.1 旋蒸瓶须洁净，且经干热灭菌。所装液量不超过1/3；6.3.2 如含乙腈等挥发性样品，易爆沸，此时应控制真空度逐渐下降；以1501408mP为宜。或按continus。运行过程中如发现爆沸应立即停止。如发现有部分液体爆沸出，立即回收。6.3.3 旋蒸不宜过浓。否则样品附壁损失严重。旋至合适程度后，以移液管转至150ml或以下规格的干净烧杯或锥形瓶中，然后加入少量无热源水重新转入旋蒸仪上旋转，使附着的样品溶解。如此反复3次。6.3.4 收集液瓶口须以Pilifilm膜封口，并加锡箔。做好标签。-35冰冻保存。7 冻干7.1 冻干瓶以容量为150ml的锥形瓶或烧杯为宜。7.2 对于Lyo-0.4，样品必须完全冻干后方可抽干。抽干过程中应经常注意观察，如发现已融化，应立即取出再次冻实后方可继续抽干。7.3 冻干时，瓶口以Pilifilm膜或锡箔封口，需在其上以针戳大量小孔。冻干完毕后，应立即以完全的膜或锡箔紧密封口，置冰箱保存。7.4 冻干结束时，应缓慢放气。压力下降过快将导致样品散出。8 保存8.1 合成的粗肽置于-35低温冰箱；8.2 已溶解的粗肽样品，如当日取用，置于-4备用，不可放置在常温环境；如第二日取用，则冰冻保存；8.3 已纯化或脱盐的样品，如无须合并，立即-35冻干；如需合并，则置于-4备用，待合并后一同冻干。8.4 最终收集样品，分段收集后，再分类合并，旋蒸后置-35保存。8.5 冻干样品严密封口后，置于-35保存。9 鉴定9.1 每批样品纯化脱盐后，分段收集，并进行HPLC纯度检测。纯度检测报告必须备档保存。9.2 对于需报送质谱的样品，由纯化人员自行标注清楚样品名称，交至负责人员统一外寄。结果应交由资料员备案。9.3 送打质谱的样品无需完全抽干。某些对盐含量有要求的质谱，需进行脱盐。10 样品的留存经检测合格的样品,特别是售出样品,均应有留存,用西林瓶装好封口,贴上标签,标签上应写明样品名称、批号、数量、纯化日期等。11 其它说明11.1 命名按技术部产品批号编制严格执行。11.2 严格标注标签